从干细胞生成肌肉谱系细胞制造技术

本发明专利技术提供了用于产生表达CD56/Pax3、CD56Pax7和/或Pax3/Pax7的细胞的方法和组合物。在一些情况下，该方法包括使体外培养物中的多潜能干细胞与一种化合物接触或与两种或更多种化合物同时接触，其中所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与一种化合物接触或与两种或更多种化合物同时接触直接导致表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的生成。还提供了使用所生成的细胞的方法。一般而言，所述化合物之一是wnt途径激活剂，如GSK3抑制剂CHIR99021。

Generation of muscle lineages from stem cells

The present invention provides a method and composition for producing cells expressing CD56/Pax3, CD56Pax7 and / or Pax3/Pax7. In some cases, the method includes the cultivation of pluripotent stem cells and in a compound or contact with two or more compounds in contact at the same time, wherein the in vitro culture of the pluripotent stem cells with a compound contact or with two or more compounds and direct contact the expression of CD56/Pax3, leading to the formation of CD56/Pax7 or Pax3/Pax7 cells. A method of using the generated cells is also provided. In general, one of the compounds described is the Wnt pathway activator, such as the GSK3 inhibitor CHIR99021.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从干细胞生成肌肉谱系细胞相关申请本申请要求于2015年4月22日提交的美国临时专利申请号62/151,352的权益，所述申请通过引用整体并入本文。背景卫星细胞为骨骼肌细胞的前体。在成人的肌肉中，卫星细胞通常是静息的(quiescent)，但可响应于疾病或机械应变如损伤或运动而激活并经历肌发生。卫星细胞还参与肌肉的正常生长。激活后，卫星细胞可以增殖。此外，这些卫星细胞中的一些可分化为成肌细胞，该成肌细胞可融合形成肌管和其他骨骼肌组分。成肌细胞还可通过与现有的肌管融合来增加现有的肌纤维。发育性和退行性的肌肉疾病和病症都可引起由于肌细胞减少或死亡而造成的肌肉功能的逐渐或突然丧失，以及由于发育性疾病造成的肌肉发育减少。先天性肌病是呈现这些特征的肌肉疾病的实例。肌肉损失还可由于衰老、疾病治疗或许多其他原因而发生。这些类型的肌肉损失的实例包括少肌症和恶病质。本领域需要针对各种类型肌肉损失的疗法。
技术实现思路
本公开内容提供了人工产生的卫星细胞或卫星样细胞，以及制备这类细胞的方法，该卫星细胞或卫星样细胞可用于与包括疾病、病症和衰老在内的各种原因相关的肌肉损失的潜在疗法。该细胞还可用于筛选以鉴别对卫星细胞具有特定效果的药物。在一方面，提供了一种产生表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的方法，该方法包括提供在体外培养物中的多潜能干细胞，以及使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与一种化合物接触或与两种或更多种化合物同时接触，其中使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与所述一种化合物接触或与所述两种或更多种化合物同时接触直接导致表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的生成。在一些实施方案中，表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞具有形成成肌细胞的潜力。在一些实施方案中，使体外培养物中的所述多潜能干细胞接触包括使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与一种化合物接触，从而直接导致所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的生成。在一些实施方案中，使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞接触包括使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与两种或更多种化合物接触，从而直接导致所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的生成。在一些实施方案中，所述方法包括在某个时间段内维持所述一种化合物在所述体外培养物中的浓度。在一些实施方案中，所述方法包括在某个时间段内维持所述两种或更多种化合物在所述体外培养物中的浓度。在一些情况下，所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的生成并非由核酸转染引起。在一些实施方案中，所述多潜能干细胞作为与其他细胞分离的单细胞进行平板接种。在一些实施方案中，所述多潜能干细胞与其他多潜能干细胞一起平板接种在单层内。在一些实施方案中，所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的生成发生在单个步骤中。在一些实施方案中，所述多潜能干细胞为人多潜能干细胞。在一些实施方案中，所述人多潜能干细胞为人胚胎干细胞。在一些实施方案中，所述人多潜能干细胞为人诱导多潜能干细胞。在一些实施方案中，所述人多潜能干细胞被遗传修饰。在一些实施方案中，所述人多潜能干细胞包含与遗传性肌肉疾病或病症相关的突变。在一些实施方案中，所述多潜能干细胞被遗传修饰以校正患有遗传疾病或病症的受试者的表型。在一些实施方案中，至少一部分所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞为Pax3/Pax7/CD56细胞。在一些实施方案中，从最初使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与所述一种化合物接触或与所述两种或更多种化合物同时接触起少于20天内，从所述多潜能干细胞产生超过五种表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞。在一些实施方案中，所述超过五种表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞为超过10种表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞。在一些实施方案中，所述少于20天为少于15天。在一些实施方案中，至少一部分所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞为卫星样细胞。在一些实施方案中，至少一部分所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞为卫星细胞。在一些实施方案中，至少一部分所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞具有横截面积为至少约170μm2的核。在一些实施方案中，所述一种化合物或所述两种或更多种化合物包含TGF-β受体抑制剂。在一些实施方案中，所述TGF-β受体抑制剂为Alk抑制剂。在一些实施方案中，所述TGF-β受体抑制剂为Alk5抑制剂。在一些实施方案中，所述两种或更多种化合物包含血清或抗坏血酸。在一些实施方案中，所述两种或更多种化合物包含马血清。在一些实施方案中，所述两种或更多种化合物包含选自运铁蛋白、XAV939、VEGF、SB431542、成纤维细胞生长因子、BIX01294、IGF-1、头蛋白(noggin)、肌酸、PD169316、SMO拮抗物和丁酸钠的化合物。在一些实施方案中，所述两种或更多种化合物包含Wnt途径激活剂或GSK3β抑制剂。在一些实施方案中，所述两种或更多种化合物包含GSK3β抑制剂。在一些实施方案中，所述GSK3β抑制剂为CHIR99021或AZD1080。在一些实施方案中，从最初使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与一种化合物接触或与两种或更多种化合物同时接触起少于20天内，从所述多潜能干细胞产生超过五种表达MyoD、MYOG或MYF5的细胞。在另一方面，提供了一种使人多潜能干细胞体外分化为能够形成成肌细胞的细胞的方法，该方法包括使所述人多潜能干细胞与两种或更多种化合物接触，其中所述两种或更多种化合物包含Wnt途径激活剂和TGF-β受体抑制剂。在一些实施方案中，所述能够形成成肌细胞的细胞表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7。在一些实施方案中，所述Wnt途径激活剂为GS3Kβ抑制剂。在一些实施方案中，所述Wnt途径激活剂以0.1μM至8μM之间的浓度存在，包括端点值。在一些实施方案中，所述GS3Kβ抑制剂为CHIR99021或AZD1080。在一些实施方案中，所述TGF-β受体抑制剂为Alk5抑制剂。在一些实施方案中，所述TGF-β受体抑制剂为SB431542。在一些实施方案中，所述TGF-β受体抑制剂为A83-01。在一些实施方案中，所述TGFβ受体抑制剂以0.1μM至10μM之间的浓度存在，包括端点值。在一些实施方案中，所述人多潜能干细胞向能够形成成肌细胞的细胞的分化发生在单个步骤中。在一些实施方案中，使所述人多潜能干细胞与所述Wnt途径激活剂和TGF-β受体抑制剂接触，Wnt途径激活剂与TGF-β受体抑制剂之比至少为1:1。在一些实施方案中，使所述人多潜能干细胞与所述Wnt途径激活剂和所述TGF-β受体抑制剂接触，Wnt途径激活剂与TGF-β受体抑制剂之比至少为3:2。在一些实施方案中，所述接触发生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的方法，该方法包括提供在体外培养物中的多潜能干细胞，并使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与一种化合物接触或与两种或更多种化合物同时接触，其中使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与所述一种化合物接触或与所述两种或更多种化合物同时接触直接导致表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的生成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.22 US 62/151,3521.一种产生表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的方法，该方法包括提供在体外培养物中的多潜能干细胞，并使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与一种化合物接触或与两种或更多种化合物同时接触，其中使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与所述一种化合物接触或与所述两种或更多种化合物同时接触直接导致表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的生成。2.如权利要求1所述的方法，其中所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞具有形成成肌细胞的潜力。3.如权利要求1所述的方法，其中使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞接触包括使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与一种化合物接触，从而直接导致所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的生成。4.如权利要求1所述的方法，其中使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞接触包括使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与两种或更多种化合物接触，从而直接导致所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的生成。5.如权利要求4所述的方法，其中所述方法包括在某个时间段内维持所述一种化合物在所述体外培养物中的浓度。6.如权利要求5所述的方法，其中所述方法包括在某个时间段内维持所述两种或更多种化合物在所述体外培养物中的浓度。7.如权利要求1所述的方法，其中所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的生成并非由核酸转染引起。8.如权利要求1所述的方法，其中所述多潜能干细胞作为与其他细胞分离的单细胞进行平板接种。9.如权利要求1所述的方法，其中所述多潜能干细胞与其他多潜能干细胞一起平板接种在单层内。10.如权利要求1所述的方法，其中所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞的生成发生在单个步骤中。11.如权利要求1所述的方法，其中所述多潜能干细胞为人多潜能干细胞。12.如权利要求11所述的方法，其中所述人多潜能干细胞为人胚胎干细胞。13.如权利要求11所述的方法，其中所述人多潜能干细胞为人诱导多潜能干细胞。14.如权利要求11所述的方法，其中所述人多潜能干细胞被遗传修饰。15.如权利要求11所述的方法，其中所述人多潜能干细胞包含与遗传性肌肉疾病或病症相关的突变。16.如权利要求1所述的方法，其中所述多潜能干细胞被遗传修饰，以校正患有遗传疾病或病症的受试者的表型。17.如权利要求1所述的方法，其中至少一部分所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞为Pax3/Pax7/CD56细胞。18.如权利要求1所述的方法，其中从最初使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与所述一种化合物接触或与所述两种或更多种化合物同时接触起少于20天内，从所述多潜能干细胞产生超过五种表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞。19.如权利要求18所述的方法，其中所述超过五种表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞为超过10种表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞。20.如权利要求18所述的方法，其中所述少于20天为少于15天。21.如权利要求1所述的方法，其中至少一部分所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞为卫星样细胞。22.如权利要求1所述的方法，其中至少一部分所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞为卫星细胞。23.如权利要求1所述的方法，其中至少一部分所述表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7的细胞具有横截面积为至少约170μm2的核。24.如权利要求1所述的方法，其中所述一种化合物或所述两种或更多种化合物包含TGF-β受体抑制剂。25.如权利要求24所述的方法，其中所述TGF-β受体抑制剂为Alk抑制剂。26.如权利要求24所述的方法，其中所述TGF-β受体抑制剂为Alk5抑制剂。27.如权利要求1所述的方法，其中所述两种或更多种化合物包含血清或抗坏血酸。28.如权利要求1所述的方法，其中所述两种或更多种化合物包含马血清。29.如权利要求1所述的方法，其中所述两种或更多种化合物包含选自运铁蛋白、XAV939、VEGF、SB431542、成纤维细胞生长因子、BIX01294、IGF-1、头蛋白、肌酸、PD169316、SMO拮抗物和丁酸钠的化合物。30.如权利要求1、24、25或26所述的方法，其中所述两种或更多种化合物包含Wnt途径激活剂或GSK3β抑制剂。31.如权利要求30所述的方法，其中所述两种或更多种化合物包含GSK3β抑制剂。32.如权利要求31所述的方法，其中所述GSK3β抑制剂为CHIR99021或AZD1080。33.如权利要求1所述的方法，其中从最初使所述体外培养物中的所述多潜能干细胞与一种化合物接触或与两种或更多种化合物同时接触起少于20天内，从所述多潜能干细胞产生超过五种表达MyoD、MYOG或MYF5的细胞。34.一种使人多潜能干细胞体外分化为能够形成成肌细胞的细胞的方法，该方法包括使所述人多潜能干细胞与两种或更多种化合物接触，其中所述两种或更多种化合物包含Wnt途径激活剂和TGF-β受体抑制剂。35.如权利要求34所述的方法，其中所述能够形成成肌细胞的细胞表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7。36.如权利要求34所述的方法，其中所述Wnt途径激活剂为GS3Kβ抑制剂。37.如权利要求34所述的方法，其中所述Wnt途径激活剂以0.1μM至8μM之间的浓度存在，包括端点值。38.如权利要求36所述的方法，其中所述GS3Kβ抑制剂为CHIR99021或AZD1080。39.如权利要求34所述的方法，其中所述TGF-β受体抑制剂为Alk5抑制剂。40.如权利要求34所述的方法，其中所述TGF-β受体抑制剂为SB431542。41.如权利要求34所述的方法，其中所述TGF-β受体抑制剂为A83-01。42.如权利要求34所述的方法，其中所述TGFβ受体抑制剂以0.1μM至10μM之间的浓度存在，包括端点值。43.如权利要求34所述的方法，其中所述人多潜能干细胞向能够形成成肌细胞的细胞的分化发生在单个步骤中。44.如权利要求34所述的方法，其中使所述人多潜能干细胞与所述Wnt途径激活剂和TGF-β受体抑制剂接触，Wnt途径激活剂与TGF-β受体抑制剂之比至少为1:1。45.如权利要求34所述的方法，其中使所述人多潜能干细胞与所述Wnt途径激活剂和所述TGF-β受体抑制剂接触，Wnt途径激活剂与TGF-β受体抑制剂之比至少为3:2。46.如权利要求34所述的方法，其中所述接触发生10天或更短。47.如权利要求34所述的方法，其中所述接触发生20天或更短。48.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述一种化合物或所述两种或更多种化合物不包含生长因子。49.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述一种化合物或所述两种或更多种化合物不包含FGF、IGF或HGF。50.如权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述一种化合物或所述两种或更多种化合物不包含FGF2。51.如权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述多潜能干细胞未与生长因子接触。52.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中由所述方法产生的所述细胞不表达选自下组的一种或多种基因：MyoD、MYOG和MYF5。53.如权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述方法不包括细胞分选。54.如权利要求53所述的方法，其中由所述方法生成的细胞中的至少约50％表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7。55.如权利要求53所述的方法，其中由所述方法生成的细胞中的至少约90％表达CD56/Pax3、CD56/Pax7或Pax3/Pax7。56.如权利要求1-55中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在涂覆有细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：乌利·施密特，莱斯利·卡伦，
申请(专利权)人：吉纳知识产权控股私人有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU