本发明专利技术一般涉及用于操作核酸分子，尤其是用于克隆、测序、扩增和突变所述分子，的方法、试剂盒和组合物。具体地，本发明专利技术涉及重组位点和重组克隆在操作、选择和分析目的核酸分子中的用途。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
技术介绍
相关领域位点特异性重组酶位点特异性重组酶是许多微生物(例如病毒和细菌)中存在的蛋白质，其特征在于具有内切核酸酶和连接酶性质。这些重组酶(在某些情况下与相关的蛋白质一起)识别DNA中的碱基特异序列并使位于那些区段侧翼的DNA区段发生交换。重组酶和相关蛋白质共同被称作“重组蛋白质”(见例如，Landy，A.，Current Opinion in Biotechnology 3699-707(1993))。不同生物的许多重组系统已有描述。见例如，Hoess等，NucleicAcids Research 14(6)2287(1986)；Abremski等，J.Biol.Chem.261(1)391(1986)；Campbell，J.Bacteriol.174(23)7495(1992)；Qian等，J.Biol.Chem.267(11)7794(1992)；Araki等，J.Mol.Biol.225(1)25(1992)；Maeser和Kahnmann，Mol.Gen.Genet.230170-176(1991)Esposito等，Nucl.Acids Res.25(18)3605(1997)。这些中的许多属于重组酶的整合酶家族(Argos等，EMBO J.5433-440(1986)；Vaziyanov等，Nucl.Acids Res.27930(1990))。其中研究最好的可能是λ噬菌体的整合酶/att系统(Landy，A.Current Opinions inGenetics and Devel.3699-707(1993))、P1噬菌体的Cre/loxP系统(Hoess和Abremski(1990)，Nucleic Acids and Molecular Biology，第4卷，编Eckstein和Lilley，Berlin-HeidelbergSperinger-Verlag；第90-109页)、和酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)2μ环状质粒的FLP/FRT系统(Broach等，Cell 29227-234(1982))。转座子转座子是可动遗传因子。转座子在结构上是可变的，被描述为简单型或复合型，但典型地编码一个转座催化酶，术语称作转座酶，该酶两侧为以倒转方向组织的DNA序列。对于转座子特性的更为完全的讨论，可以参考Mobile Genetic Elements，D.J.Sherratt编，OxfordUniversity出版(1995)和Mobile DNA，D.E.Berg和M.M.Howe编，American Soceity fot Microbiology(1989)，Washington，DC，两本书均特此并入本文作为参考。转座子已被用于将DNA插入靶DNA序列中。作为一般原则，转座子在靶DNA的插入是随机事件。该原则的一个例外是转座子Tn7的插入。作为生命周期的一个部分，转座子Tn7可以将自身整合到大肠杆菌(E.coli)基因组的特异位点中(Stellwagen，A.E.和Craig，N.L.Trends inBiochemical Sciences 23，486-490，1998，特此并入本文作为参考)。该位点特异性插入已被用于体内操作杆状病毒的基因组(Lucklow等，J.Virol.674566-4579(1993)，特此并入本文作为参考)。对于其特点为向受体DNA分子中的随机位置移动的可转座元件而言，Tn7的位点特异性是非典型的。为了本申请的目的，除非另行指出，转座将用于指随机或半随机的移动，而重组将用于指位点特异性重组事件。因此，Tn7在attTn7位点中的位点特异性插入将被称作重组事件，而Tn7的随机插入将被称作转座事件。York等(Nucleic Acids Research，26(8)1927-1933，(1998))公开了基于使用Tn5在质粒分子内的转座事件制备嵌套缺失的体外方法。含有侧翼为两个19碱基对的Tn5转座酶识别序列及靶DNA序列的卡那霉素抗性基因的载体，在存在纯化的转座酶蛋白质的情况下作体外孵育。在使用低DNA浓度的条件下，有利于分子内转座反应发生，该反应被成功用于在靶DNA中制备一套嵌套缺失。这些作者提出，通过将终止信号包括在识别序列相邻的所有三种阅读框中，该系统可以用于在靶DNA编码的蛋白质中产生C端截短。此外，这些作者提出，将His标签和激酶区域包含在内可以用于制备N端缺失蛋白质以便作进一步分析。Devine等(Nucleic Acids Research，223765-3772(1994)和美国专利5,677,170和5,843,772，所有均特此并入本文作为参考)公开了用于体外将DNA区段插入受体DNA分子中的人工转座子的构建。该系统利用酵母YT1病毒样颗粒的插入催化酶作为转座酶活性的来源。使用标准方法，将目的DNA区段克隆在转座子样元件TY1两末端间。当存在TY1插入催化酶时，所获元件将随机整合至第二靶DNA分子中。重组位点由以上提及的重组蛋白介导的重组反应的一个关键特征是DNA分子上参与重组反应的常称作“重组位点”的识别序列。这些重组位点是参加的核酸分子上被重组蛋白质在重组过程中识别和结合的不连续DNA部分或区段。例如，Cre重组酶的重组位点是34个碱基对序列的loxP，该序列由位于8碱基对核心序列侧翼的两个13碱基对反向重复(充当重组酶识别位点)组成。见Sauer，B.，Curr.Opin.Biotech.5521-527(1994)的附图说明图1。识别序列的其它例子包括重组蛋白1 Int所识别的attB、attP、attL、和attR序列。attB为含有两个9碱基对核心型Int结合位点和一个7碱基对重叠区的约25碱基对序列，而attP为含有核心型Int结合位点和臂型Int结合位点以及辅助蛋白质即整合宿主因子(IHF)、FIS和外切酶(Xis)的位点的约240个碱基对序列。见Landy，Curr.Opin.Biotech.3699-707(1993)。核酸测序历史上，使用两种主要技术测序核酸。第一种方法以其共开发者命名为“Maxam和Gilbert测序”(Maxam，A.M.和Gilbert，W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74560-564，1997)，在该方法中DNA被放射性标记，之后被分成四个样品，并用选择性破坏DNA中特异核苷酸碱基和在破坏位点切割分子的化学药品进行处理。通过利用凝胶电泳将所获片段分离为离散条带并将凝胶暴露于X光片，可以从该胶片上读出最初DNA分子的序列。已使用该技术测定了某些复杂DNA分子的序列，包括灵长类动物病毒SV40(Fiers，W.等，Nature 273113-120，1978；Reddy，V.B.等，Science 200494-502，1978)和细菌质粒pBR322(Sutcliffe，G.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.4377-90，1979)的序列。测序的另一技术以其开发者命名为“Sanger测序”(Sanger，F.和Coulson，A.R.，J.Mol.Biol.94444-448，1本文档来自技高网...
【技术保护点】
包含至少一个重组位点或其部分的整合序列。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：MA布拉什，JL哈特利，GF坦普勒，
申请(专利权)人：茵维特罗根公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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