利用多识别位点合成核酸分子的方法和组合物技术

本发明专利技术提供用于重组克隆的组合物和方法。该组合物包含含有多个重组位点和／或多个拓扑异构酶识别位点的载体。该方法允许同时克隆两种或多种不同的核酸分子。在一些实施方案中，这些分子融合在一起，而在其它实施方案中，这些分子插入一种载体中的不同位点内。本发明专利技术通常也用于通过重组连接可能相同或者可能不同的多种分子和／或化合物（例如化学化合物、药物、蛋白质或肽、脂类、核酸、碳水化合物等）。本发明专利技术或按照本发明专利技术的方法准备，也提供包含本发明专利技术的组合物、宿主细胞和核酸分子的试剂盒，它们可用来根据本发明专利技术的方法合成核酸分子。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
专利
本专利技术涉及生物技术和分子生物学领域。具体而言，本专利技术涉及连接多种含有一个或多个重组位点和/或一个或多个拓扑异构酶识别位点的核酸分子。本专利技术也涉及利用重组克隆方法克隆这些连接的核酸分子，例如使用拓扑异构酶和/或重组蛋白的方法。本专利技术也涉及利用重组位点和/或拓扑异构酶识别位点连接多种肽以及肽与核酸分子的组合。其它分子和化合物或分子和化合物的组合也可以通过根据本专利技术的重组位点和/或拓扑异构酶识别位点连接。这些肽、核酸和其它分子和/或化合物(或其组合)也可以通过重组反应和/或通过拓扑异构酶连接反应与根据本专利技术的一种或多种载体或结构连接或结合。相关技术位点特异性重组酶位点特异性重组酶是多种生物(例如病毒和细菌)中存在的蛋白质，已经被表征为具有内切核酸酶和连接酶特性。这些重组酶(在一些情况下与结合的蛋白质一起)识别核酸分子中的特异碱基序列，并交换位于这些序列侧翼的核酸片段。重组酶和结合的蛋白质通称为“重组蛋白”(参见，例如Landy，A.，Current Opinion in Biotechnology3699-707(1993))。已经描述了来自不同生物的大量重组系统。参见，例如Hoess等人，Nucleic Acids Research 14(6)2287(1986)；Abremski等人，J.Biol.Chem.261(1)391(1986)；Campbell，J.Bacteriol.174(23)7495(1992)；Qian等人，J.Biol.Chem.267(11)7794(1992)；Araki等人，J.Mol.Biol.225(1)25(1992)；Maeser和Kahnmann，Mol.Gen.Genet.230170-176(1991)；Esposito等人，Nucl.Acids Res.25(18)3605(1997)。其中许多属于重组酶的整合酶家族(Argos等人，EMBO J.5433-440(1986)；Voziyanov等人，Nucl.Acids Res.27930(1999))。其中研究最多的也许是来自噬菌体的整合酶/att系统(Landy，A.Current Opinions inGenetics and Devel.3699-707(1993))、来自噬菌体P1的Cre/LoxP系统(Hoess和Abremski(1990)，《核酸与分子生物学》，第4卷，编者Eckstein和Lilley，Berlin-HeidelbergSpringer-Verlag；pp.90-109)，和来自酿酒酵母2μ环形质粒的FLP/FRT系统(Broach等人，Cell29227-234(1982))。重组位点无论上述反应被称为重组、转座还是整合，是由重组酶、转座酶还是整合酶催化，它们在参与反应的核酸分子上都共有特异识别序列的主要特征，通常称为“重组位点”。这些重组位点是在整合或重组最初阶段由重组蛋白识别并结合的有关核酸分子上的核酸部分或片段。例如，Cre重组酶的重组位点是loxP，它是34个碱基对的序列，由位于8碱基对核心序列侧翼的两个13碱基对的反向重复序列(作为重组酶结合位点)组成。参见Sauer，B.，Curr.Opin.Biotech.5521-527(1994)中的附图说明图1。识别序列的其它例子包括可被重组蛋白识别的attB、attP、attL和attR序列。(Int.attB是一种约25碱基对的序列，含有两个9碱基对的核心型Int结合位点，和一个7碱基对的重叠区，而attP是一种约240碱基对的序列，含有核心型Int结合位点和臂型Int结合位点，以及辅助蛋白整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)的位点。见Landy，Curr.Opin.Biotech.3699-707(1993))。常规核酸克隆核酸片段的克隆现在在许多研究实验室已是常规，是许多遗传分析的必要步骤。然而，这些克隆的目的不同，一般可考虑两个目的(1)最初从大DNA或RNA片段(染色体、YACs、PCR片段、mRNA等)克隆核酸，这在相对少数的已知载体如pUC、pGem、pBlueScript中进行，和(2)这些核酸片段向特化载体内的亚克隆，以进行功能分析。大量时间和精力花费在将核酸片段从最初的克隆载体向更特化的载体转移的过程中。这种转移被称为亚克隆。克隆的基本方法已经知道很多年，在这段时间内没有多少改变。一个典型克隆方案如下(1)用一种或两种限制性内切酶消化目的核酸；(2)知道时，凝胶纯化目的核酸片段；(3)适当时，通过用适当限制性内切酶酶切、用磷酸酶处理、凝胶纯化等，制备载体。(4)连接核酸片段与载体，用适当的对照除去未酶切和自连接的载体背景；(5)将得到的载体导入大肠杆菌宿主细胞内；(6)挑取选择的菌落，培养小量培养物过夜；(7)制备核酸小量制备物；和(8)在琼脂糖凝胶上(通常在诊断性限制性内切酶消化后)或通过PCR分析分离的质粒。用于亚克隆核酸片段的特化载体是功能多样化的。包括但不限于在不同生物中表达核酸分子的载体；调节核酸分子表达；提供有助于蛋白质纯化或允许示踪细胞中蛋白质的标记；用于修饰克隆的核酸片段(例如产生缺失)；用于合成探针(例如核糖探针)；为核酸测序制备模板；用于鉴定蛋白质编码区；用于不同蛋白质编码区的融合；产生大量目的核酸，等等。一项具体研究通常包括向几种不同的特化载体内亚克隆目的核酸片段。本领域公知，简单的亚克隆能在一天内完成(例如，核酸片段不大，限制酶切位点与亚克隆载体的位点相容)。然而，其它许多亚克隆可能要花费几周的时间，特别是那些关于未知序列、长片段、毒性基因、限制酶切位点位置不当、高背景、酶不纯等的亚克隆。最冗长、耗时最长的亚克隆类型之一包括，为了构建希望的克隆，向载体上依次添加几种核酸片段。这类克隆的一个例子是基因靶向载体的构建。基因靶向载体一般包含两个核酸片段，其中每一个都与靶基因的一部分相同，位于一个选择性标记侧翼。为了构建这种载体，必须依次克隆每个片段，即，首先将一个基因片段插入载体内，然后插入选择性标记和第二个靶基因片段。对于克隆的每个片段，可能需要大量消化、纯化、连接和分离步骤。因此，亚克隆核酸片段通常被视为尽可能少进行的琐事。曾经描述了几种促进核酸片段克隆的方法，例如，下列参考文献所述。Ferguson，J.等人，Gene 16191(1981)公开了用于亚克隆酵母核酸片段的一个载体家族。这类载体编码卡那霉素抗性。能够部分消化较长酵母核酸片段的克隆，并连接于亚克隆载体内。如果最初的克隆载体提供氨苄青霉素抗性，则在转化之前不必纯化，因为将进行卡那霉素筛选。Hashimoto-Gotoh，T.等人，Gene 41125(1986)公开了在链霉素敏感性基因内含有独特克隆位点的一种亚克隆载体；在链霉素抗性宿主中，只有显性敏感性基因含有插入或缺失的质粒才能在链霉素筛选后存活。尽管这些方法具有改进，但是采用限制性内切酶和连接酶的传统亚克隆仍是耗时且相对不可靠的。耗费了大量的劳动，并且如果在两天或更多天以后在候选质粒中没有发现希望的亚克隆，则必须用备选条件重复整个过程。重组克隆以前在美国专利号5,888,732、6,143,557、6,171,86本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，其包含：（ａ）一个或多个重组位点；和（ｂ）一个或多个拓扑异构酶识别位点和／或一个或多个拓扑异构酶。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：JD切斯纳特，J卡利诺，L利昂，K马丹，M格里森，J范，MA布拉施，D切奥，JL哈特里，DRN伯德，GF坦普尔，
申请(专利权)人：茵维特罗根公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]