植酸酶APPB及编码该植酸酶的DNA制造技术

本发明专利技术涉及一种植酸酶ＡＰＰＢ；编码该植酸酶的ＤＮＡ；含有该植酸酶的表达载体；含有该表达载体的重组酵母细胞；含有该植酸酶的动物食品。该植酸酶ＡＰＰＢ比活性高、能同时抗胃蛋白酶和胰蛋白酶、表达能力强的，比现有植酸酶的生产成本降低，而含有该植酸酶的动物饲料制品则可以用于酶解动物体内的植酸磷。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植酸酶，特别涉及一种植酸酶APPB，同时还涉及编码该植酸酶的DNA，及含有该植酸酶的表达载体和含有该表达载体的重组酵母细胞。中国专利技术专利97121731.9公开了一种植酸酶，该植酸酶在小试水平上表达量达到5×105U/mL，中试水平上将表达量提高到1×106U/mL发酵液。但在这项研究中，由于所采用的植酸酶比活性较低，虽然在重组菌株中植酸酶的绝对表达量已达到了10mg酶蛋白/mL发酵液，达到了较高的水平，但单位体积发酵液中的酶活性还是偏低，因而生产成本较高。植酸酶的抗胰蛋白酶和胃蛋白酶的能力是影响植酸酶实际应用效果的关键因素之一。植酸酶的作用场所是动物的胃肠道，动物在胃肠道中分泌胃蛋白酶、胰蛋白酶等多种蛋白酶以消化食物，植酸酶本身就是一种蛋白质，也有可能被这些蛋白酶降解而失去活性，这就要求植酸酶必需对动物胃肠道中的蛋白酶有一定的抗性。2000年Igbasan(Igbasan.Arch anim nutr，53353-373，2000)的研究结果表明，真菌来源的植酸酶，包括目前商品化的植酸酶，其抗胃蛋白酶的能力均较差，用胃蛋白酶处理60分钟后，植酸酶的剩余活性不超过33％，仅有大肠杆菌来源的植酸酶APPA剩余活性还维持在95％左右，具有很好的抗胃蛋白酶能力。但是，Rodriguez的进一步研究发现(Rodriguez.Arch BiochemBiophys，365262-267，1999)，APPA虽具有好的抗胃蛋白酶能力，但它确不抗胰蛋白酶，处理30分钟和2小时后，酶活性分别丧失了87％和95％。本专利技术的目的是通过以下途径来实现的。植酸酶APPB，它是一种具有APPB ID NO1所示的氨基酸序列的纯化的植酸酶。本专利技术中生物植酸酶APPB来源于一种大肠杆菌生物，它具有很好的同时抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力。目前报道绝大部分植酸酶，包括来源于曲霉等真菌和芽孢杆菌的植酸酶均不抗胃蛋白酶(Igbasan.Archanim nutr，53353-373，2000)，而来源于大肠杆菌的植酸酶APPA(Greiner，Arch Biochem Biophys，303107-113，1993；Rodriguez，Biochem Biophys Res Commun，257117-123，1999)有很好的胃蛋白酶抗性，但对胰蛋白酶抗性很差(Rodriguez.Arch Biochem Biophys，365262-267，1999)。目前还未有报道同时对胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有高抗性的植酸酶。本专利技术采用纯化后的植酸酶APPB来进行抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力的测定，结果发现，胃蛋白酶和胰蛋白酶作用2小时后，植酸酶的酶活性都依然维持在90％以上，具有很好的同时抗胃蛋白酶和胰蛋白酶活性(见附图说明图1)。本专利技术中的植酸酶APPB具有高比活性，它的比活性达到3.2×106U/mg酶蛋白，比曲霉来源的植酸酶(1×105U/mg)高30倍(见VanGorcom R.F.M.et al.，1995；姚斌等，中国专利技术专利97121731.9，2000)，比Peniophora来源的植酸酶(Lassen，US Patent 6060298，2000)高6倍。可见本专利技术植酸酶APPB具有比现有技术中植酸酶更高的比活性。本专利技术的植酸酶可通过PCR技术、定点突变技术、基因设计后化学合成等技术来改造，使用表达系统进行表达。可选择的表达系统包括低等真核表达系统如酵母、丝状真菌等；原核表达系统大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、杆状病毒等；高等真核表达系统如玉米、大豆、水稻、猪、鸡、鸭及各种鱼类和昆虫等。本专利技术中，为了使植酸酶基因能在毕赤酵母中高效表达，我们通过PCR的方法将植酸酶基因APPB原有的信号肽序列除掉，改造后的植酸酶基因插入到带有α-因子信号肽序列的酵母表达载体上，经转化酵母细胞后，稳定整合到酵母染色体上，此重组酵母经发酵培养后，表达的植酸酶蛋白在信号肽的引导下分泌到培养基中。经测定，植酸酶表达量达到4×106U/mL，比国际表达水平最高的专利(VanGorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995)所报道的高近15倍。本专利技术经研究结果还表明(如图2所示)，表达的植酸酶随诱导时间的增加而积累，在诱导106小时时达到高峰，这时的表达量达到4mg/mL发酵液时，酶活性达到4×106U/mL发酵液。表达的酶蛋白分子量大小约为50kD，比植酸酶的理论分子量大5kDa左右，这可能是因为进行了蛋白翻译后修饰—糖基化。以上结果证明植酸酶基因不仅得到了表达、有效分泌，且表达的植酸酶具有正常的生物学活性。该植酸酶1)分子量为45Kda；2)活性的pH值范围为2.0～7.5；3)稳定性的pH值范围为2.0～9.0；4)活性的温度范围为4～75℃；5)稳定性的温度范围为4～75℃。进一步讲还在于该植酸酶1)性的最适pH值范围为4.5；2)活性的最适温度范围为35～60℃。本专利技术还可以经如下方式来实现。编码如APPB ID NO1所示的氨基酸序列的纯化的植酸酶的DNA。可以具体为编码如APPB ID NO1所示的氨基酸序列的纯化的植酸酶的DNA，其具有APPB ID NO2所示的核苷酸序列。本专利技术对已报道的来源于大肠杆菌的植酸酶基因序列(Rodriguez，Biochem Biophys Res Commun，257117-123，1999)，设计合成克隆植酸酶APPB基因所需的PCR引物P1和P2P15’TCGAATTCATGAAAGCGATCTTAATCCCA 3’P25’CTGAATTCTTACAAACTGCACGCCGG 3’以大肠杆菌CGMCC1.1541的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，然后通过DNA全序列分析结果表明，植酸酶APPB结构基因全长1299个核苷酸，编码432个氨基酸，N端的22个氨基酸为信号肽。从氨基酸推断出的理论分子量约为45kDa。此基因与来源于真菌的植酸酶基因相比，同源性很低，与来源于大肠杆菌的appA(Dassa，Mol Gen Gent，20068-73，1985；Greiner，Arch Biochem Biophys，303107-113，1993)和appA2(Rodriguez，Biochem Biophys Res Commun，257117-123，1999)基因有较高的同源性，氨基酸序列同源性分别达到97.9％和96.7％，分别有9个和15个氨基酸的差异，但APPB编码的植酸酶同时具有抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力，而报道的同样来源于大肠杆菌的appA和appA2编码的植酸酶却不能抗胰蛋白酶，综合基因序列和酶学性质上的差异，证明植酸酶APPB是一性质更为优良的植酸酶新基因。一种复制和表达载体，它含有编码如APPB ID NO1所示的氨基酸序列的纯化的植酸酶的DNA。这种复制和表达载体可以再具体为它含有编码如APPB ID NO1所示的氨基酸序列的纯化的植酸酶的DNA，并且该DNA具有APPB ID NO2所示的核苷酸序列。载体为可复制的DNA构建体。它用于扩增、表达编码植酸酶APPB的基因，也可以用于扩大生产、克隆植酸酶APPB的基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
植酸酶ＡＰＰＢ，其特征在于，它是一种具有ＡＰＰＢ ＩＤ ＮＯ：１所示的氨基酸序列的纯化的植酸酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，饶平凡，叶秀云，陈躬瑞，刘树滔，陈娟，
申请(专利权)人：福建福大百特科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]