本发明专利技术提供了成纤维细胞生长因子－２的结构类似物及其生产方法，含有这些类似物及医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物，以及该组合物在治疗组织损伤中的应用。本发明专利技术的ＦＧＦ－２结构类似物与天然的人ＦＧＦ－２相比具有较好的储存稳定性，以及对温度和ｐＨ的耐受性。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
,其生产方法及应用的制作方法
本专利技术涉及及其生产方法，含有这些类似物及医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物，以及该组合物在治疗组织损伤中的应用。多肽生长因子是细胞增殖和分化的激素样调节剂。已经从各种组织和细胞中分离并鉴定了许多生长因子，其中包括但不只限于表皮生长因子，血小板衍生的生长因子、神经生长因子、造血细胞生长因子、以及成纤维细胞生长因子。成纤维细胞生长因子(FGF)最初是作为对BALB/c 3T3细胞具有生长促进活性的因子，从牛脑垂体组织中分离的(D.Gospodarowicz，Nature 249123，1974)。该分子对酸和温度敏感，并具有高的(碱性)等电点。后来发现从脑中分离的促细胞分裂因子与此前从脑垂体中分离的不同，因而基于它们具有相似的生物学活性和不同的等电点而分别称为酸性和碱性FGF(即aFGF和bFGF)。aFGF和bFGF是至少8种结构上相关的、具有肝素结合能力的分子家族的成员，它们可以选择性地激发包括中胚层细胞和神经外胚层细胞在内的许多细胞的生物学反应，这些细胞包括内皮细胞、平滑肌细胞、肾上腺皮质细胞、成肌细胞及成骨细胞。已基于对细胞增殖和分化的调节活性及与FGF的序列同源性鉴定了另外7个FGF家族的成员，其中包括hst/k和int致癌基因，及称为FGF-5的前原癌基因。作为原始FGF家族成员，现将酸性和碱性FGF分别称为FGF-1和FGF-2，本说明书下文中将碱性成纤维细胞生长因子称为FGF-2。除了刺激细胞生长外，FGF还可刺激许多类型的细胞以非有丝分裂方式发生不同的反应，例如促进细胞向受伤部位迁移(趋化因子活性)、促进新的血管生成、调节神经退化和存活性(神经营养活性)、调节内分泌功能以及刺激或抑制特异性细胞蛋白质表达、细胞外基质产生及细胞存活等(Baird，A.and Bohler，P.，Handbook of Exp.Pharmacol.，95(1)369-418，1990)。这些性质为使用FGF制备用来加速伤口愈合、神经组织修复、预防和治疗脑和心肌局部缺血(侧枝血管生成)的药物提供了基础。牛FGF-2(bFGF-2)是具有154个的氨基酸的多肽。人FGF-2(hFGF-2)不同于bFGF-2在于其第121位氨基酸是苏氨酸(Thr)而不是丝氨酸(Ser)，第137位氨基酸是丝氨酸(Ser)而不是脯氨酸(Pro)。人或牛FGF-2分子可以包含7-11个氨基酸的N末端延伸部分，也可以是在N末端缺失1个或多个，例如大约4-30个氨基酸，并仍保留其生物学活性的分子。这些事实体现了FGF分子N末端的不均一性。J.A.Abraham等人(Science 233545-548，1986；EMBOJ.，52523-2528，1986)首先克隆了牛/人FGF-2的核苷酸序列。在继后的许多研究中，为了进一步了解FGF分子结构与功能的关系，前体与产物的关系，以及分子的受体结合特性和三维空间结构(参见Eriksson，E.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883441-3445，1991；Zhu，H.et al.，Science25190-93，及美国专利5,491,220)已进行了大量工作。为了改善野生型FGF分子的受体结合特异性，并进一步从中筛选适于作为FGF功能拮抗剂或激动剂的变异体，或者期望得到适于作为药物应用的抗聚合的和/或稳定化的变异体，已经在基础研究工作的基础上制备并公开了许多FGF突变体或结构类似物(例如参见美国专利5,175,147、5,288,704及欧洲专利申请EP-A 281,822和英国专利申请8821795.5)。日本专利公开号JP231428/86(相当于中国专利申请公开号CN101486A)公开了使用定点诱变技术分别将成熟的人碱性成纤维细胞生长因子(hFGF-2)序列第69和87位的半胱氨酸改变为丝氨酸，以期阻止分子间二硫键形成和多聚化作用。另外，文献还报道了用丝氨酸取代人白介素2(IL-2)中的特定半胱氨酸残基以有利于防止分子间聚合的方法(Science2241431，1984)。然而，丝氨酸是一种没有氨基基团的三碳原子氨基酸，所以难以使用某些多糖或纤维素或聚乙二醇与生物活性多肽分子的氨基反应基团结合，以便防止分子多聚化并提高其在水溶液中及在接受者体液内的稳定性。为此，有人提出将包括G-CSF和促红细胞生成素在内的生物学活性多肽分子中的一个或多个赖氨酸改变成其他氨基酸，以利于分子的聚乙二醇化(美国专利4,904,584)。另一方面，虽然许多文献报道了在大肠杆菌中表达hFGF-2突变蛋白质的方法，但为了从大肠杆菌包含体中分离纯化所需的表达产物，往往因加入强蛋白质变性剂而导致产物失活。以前的研究工作表明，FGF-2如许多其他以重组技术得到的蛋白质一样，无论是在溶液状态下或冷冻干燥状态下，均很容易减低或丧失活性。因此，尽可能地减少原核细胞或酵母宿主体内包含体的形成数目，并增加可溶性部分中产物的得率是本领域亟待解决的问题。虽然Studier F.M.等人(Journal of Molecular Biology 189113-130，1983)首先发现利用T7启动子可有利于提高表达水平，但表达产物却缺乏足够的生物学活性(Paris，N.et al.，Biotechology and Applied Biochemistry 12436-449，1990)。此外，在我们的实验室进行的早期研究工作中发现，FGF分子与硫酸肝素的结合刚性大小和所使用的层析柱的组合次序，对分离和纯化宿主细胞可溶性部分中表达产物的收率具有很大影响。本专利技术人从牛脑垂体中克隆了编码具有bFGF-2活性之多肽的DNA序列，并在大肠杆菌宿主中成功地表达了所说的多肽。该多肽产物是以N端上游区连接有LacZα之部分序列(约17个氨基酸)的“融合”蛋白质的形式被表达的。在此基础上，又经定点人工诱变，将bFGF-2编码序列中第121位丝氨酸和第137位脯氨酸密码子分别改变为苏氨酸和丝氨酸密码子，并删除bFGF-2 DNA编码序列之N末端上游非FGF结构基因的序列，从而得到编码hFGF-2)的DNA序列，并在原核宿主中高水平表达了hFGF-2。为了进一步改善hFGF与硫酸多糖结合的能力和稳定性，提高其对抗分子间聚合的能力，以及对低pH和热的耐受性，本专利技术对hFGF-2的一级结构进行了基因水平上的位点特异性修饰，用除半胱氨酸以外的其他氨基酸，较好是用精氨酸取代暴露于FGF-2分子表面的半胱氨酸，得到hFGF-2的结构类似物(以下有时简称FGF-2m)。经初步实验结果表明，该类似物具有较好的硫酸多糖结合刚性，以及对低pH和热的耐受性。因此，本专利技术的一个目的是提供一种以融合蛋白质形成产生的，具有成纤维细胞生长因子活性的多肽，该多肽具有如附图说明图1或图2所示的氨基酸序列。根据本专利技术这一个目的的一个实施方案，其中所说的融合蛋白质包含实质上完整的人或牛FGF-2的氨基酸序列，并在其N端连接有大约17个氨基酸的非FGF-2结构蛋白质序列，所说的非结构蛋白质序列是由用于在原核宿主中启动表达的LacZα肽基因的部分序列编码的，其有利于FGF-2翻译的起始，提高可溶性部分中活本文档来自技高网...
【技术保护点】
以融合蛋白质形式产生的，具有成纤维细胞生长因子活性的如图３所示的氨基酸序列的多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林剑，刘小青，洪岸，李校堃，陈小佳，李志英，
申请(专利权)人：暨南大学生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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