超氧化物歧化酶生产方法技术

一种超氧化物歧化酶，它是由将分离、洗涤干净的红细胞，加入去离子水搅拌、静置，再加入乙醇，氯仿搅拌、静置，用盐酸调ｐＨ为５．８－６．０的上清液，然后用丙酮沉淀，加入含硫酸盐的蒸馏水，再利用２ＮＨＣｌ调溶液ｐＨ为５．８－６．０，然后加热变性，分离、过滤所得到超氧化物歧化酶，该生产方法简单，生产周期短，产品外观好，活性高，使用范围广，特别适合于生物医药、化妆品添加剂及食品加工领域。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，特别是涉及一种，目前，我国超氧化物歧化酶(SOD)超氧阴离子自由基的清除剂，可用于过量超氧阴离子自由基引起的疾病或机体损佃的防治，如类风湿性关节炎、放射性损伤、血液再灌流损伤等。但原有的一些老的方法生产的该产品外观和活性都不是非常理想。例如有使用硫酸铵盐析法去除杂蛋白，再用磷酸盐缓冲液透析方法脱盐，这不仅给产品中带入了杂离子，还使得获得产品的步骤增加，生产周期延长。现在克服超氧化物歧化酶外观不好及活性低等缺点的方法主要是用凝胶过滤，但该方法的费用非常高，产品的收率低，生产周期过长，影响大规模生产，限制了超氧化物歧化酶在医药及食品领域中的应用。本专利技术的目的就是要提供一种方法简单，生产周期短，产品收率高，应用范围广，外观好，活性高的超氧化物歧化酶的生产方法。本专利技术的目的是这样实现的一种，其特征在于它包括以下步骤1、溶血、去血红蛋白，去酸性蛋白将分离、洗涤干净的红细胞置于反应罐中，加入去离子水搅拌、静置，搅拌时间≥3小时，静置时间≥2小时，再加入乙醇，氯仿搅拌、静置，搅拌时间≥4小时，静置时间≥2小时，后用HCl调溶液pH为5.8-6.0后分离，得到去血红蛋白，去酸性蛋白的上清液；2、热变性、超滤将上述上清液加入丙酮得到颗状沉淀物，再加入蒸馏水搅拌溶解，然后加入硫酸盐，用HCl溶液调pH为5.8-6.0，搅拌加热变性，加热温度≤70°，保温≥10分钟，再分离去杂蛋白，最后将溶液用超滤机超滤，得到超氧化物歧化酶浓缩液。本专利技术还可以在第二步后加入干燥工艺，即将得到的超氧化物歧化酶浓缩液除菌过滤，冷冻干燥得到冻干粉的超氧化物歧化酶，硫酸盐最佳为硫酸铜，用于保护酶的活性中心，超滤机采用截留值为一万的聚砜中空纤维超滤机。本专利技术与现有技术相比具有以下优点1、工艺过程简单，仅用二次调pH就能达到理想的结果；生产周期短，节约开支。制得的超氧化物歧化酶产品与其他方法制得的超氧化物歧化酶相比具有外观好、收率高、活性强、稳定性高，不易失活等特性。用作化妆品添加剂，稳定性明显增加，从而能在化妆品中较长时间的保持较高的活性。2、本专利技术制得的超氧化物歧化酶产品，经试验验证加到鲜牛奶中也能够保持较高的活性。3、本专利技术生产的超氧化物歧化酶产品，因杂质少、纯度高、活性强与其他生化药物修饰在一起，其在动物体内的半衰期明显延长，动物试验用于治疗脑血管方面的疾病已取得了非常满意的结果。下面结合实施例对本专利技术做进一步说明实施例1取新鲜动物血，按血量1∶0.038的比例加入枸橼酸三纳，静置2小时。分离、洗涤干净红细胞，采用4000rpm/min离心机离心30min，再加入等体积的0.9％的生理盐水洗涤二次，用4000rpm/min离心机离心30min，得到干净的红细胞，将干净的红细胞置于反应罐中，加入溶液等体积的去离子水，搅拌溶液3小时，静置2小时，得到的溶液再按与溶液体积比的0.25倍的医用工业乙醇和0.15倍的氯仿进行搅拌、静置，搅拌时间为4小时，静置2小时，再加入2NHCl将溶液调至pH为5.8，利用4000rpm/min离心机离心，得到澄清透明的淡黄色液体，然后加入与溶液体积比为1.5倍的丙酮，静置过液得到超氧化物歧化酶的白色颗粒状沉淀物，然后将沉淀物加入2倍量的蒸馏水搅拌溶解，再加入0.1％的硫酸铜溶液5ml，用以保护酶的活性中心，再加入2NHCl使溶液的pH为6.0，再投入70℃的热变锅内加热变性，保温10分钟，再用3000rpm/min离心机离心去除杂蛋白，最后将溶液放入分子量截留值为一万的聚砜中空纤维膜超滤机中超滤，从而得到浓缩的超氧化物歧化酶，真空干燥得产品。实施例2与实施例1不同在于所得到的浓缩超氧化物歧化酶进行冷冻干燥，先除菌过滤，然后进行冷冻干燥，即可得到冷冻干燥的超氧化物歧化酶。实施例3与实施例1相同的是分离、洗涤干净的红细胞，其不同之处在于将干净的红细胞置于反应罐中加入与溶液不等体积的去离子水，搅拌溶血4小时，静置3小时，得到的溶液再按溶液体积比分别加入0.35倍的医用工业乙醇和0.2倍的氯仿进行搅拌、静置。搅拌、静置时间同实施例1，再用2NHCl，将溶液调至pH为6.0，利用40000rpm/min离心机离心得到淡黄色液体，然后加入与溶液体积比为1倍的丙酮，静置得到超氧化物歧化酶的沉淀物。加入等量的蒸留水搅拌溶解，再加入0.1％的硫酸铜溶液5ml，加入2NHCl，使溶液的pH为6.0，再投入60℃的热变锅内加热变性，保温12分钟，再用3000rpm/min离心机离心，去除杂蛋白，用超滤机超滤得到浓缩液，浓缩液再除菌过滤进行冷冻干燥即可得到冻干粉状的超氧化物歧化酶。权利要求1.一种超氧化歧化酶生产方法，其特征在于它包括以下步骤(1)溶血、去血红蛋白、去酸性蛋白，洗涤干净的红细胞置于反应罐中，加入去离子水搅拌、静置，搅拌时间≥3小时，静置时间≥2小时，再加入乙醇、氯仿搅拌、静置，搅拌时间≥4小时，静置≥2小时，后用HCl调溶液pH为5.8-6.0，然后分离，得到去血红蛋白、去酸性蛋白的上清液。(2)热变性、超滤将上清液加入丙酮得到颗粒状沉淀物，再加入蒸馏水搅拌溶解，然后加入硫酸盐，用HCl溶液pH为5.8-6.0，搅拌加热变性，加热温度≤70℃，保温≥10分钟，再分离去杂蛋白，最后用超滤机超滤，得到超氧化物歧化酶。2.根据权利要求(1)所述的，其特征在于所述的第二步后加入干燥工艺，即将浓缩液除菌过滤，冷冻干燥的冻干超氧化物歧化酶。3.根据权利要求(1)或(2)所述的，其特征在于所述的硫酸盐最佳为硫酸铜。4.根据权利要求3所述的，其特征在于所述的超滤机采用截留值为一万的聚砜中空纤维超滤机。全文摘要一种超氧化物歧化酶，它是由将分离、洗涤干净的红细胞，加入去离子水搅拌、静置，再加入乙醇，氯仿搅拌、静置，用盐酸调pH为5.8－6.0的上清液，然后用丙酮沉淀，加入含硫酸盐的蒸馏水，再利用2NHCl调溶液pH为5.8－6.0，然后加热变性，分离、过滤所得到超氧化物歧化酶，该生产方法简单，生产周期短，产品外观好，活性高，使用范围广，特别适合于生物医药、化妆品添加剂及食品加工领域。文档编号C12N9/02GK1506458SQ0213597公开日2004年6月23日 申请日期2002年12月10日 优先权日2002年12月10日专利技术者曹吉超, 崔程剑, 王凤山, 姚凯军 申请人:烟台养合生物工程有限公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种超氧化歧化酶生产方法，其特征在于它包括以下步骤：（１）溶血、去血红蛋白、去酸性蛋白，洗涤干净的红细胞置于反应罐中，加入去离子水搅拌、静置，搅拌时间≥３小时，静置时间≥２小时，再加入乙醇、氯仿搅拌、静置，搅拌时间≥４小时，静置≥２ 小时，后用ＨＣｌ调溶液ｐＨ为５．８－６．０，然后分离，得到去血红蛋白、去酸性蛋白的上清液。（２）热变性、超滤：将上清液加入丙酮得到颗粒状沉淀物，再加入蒸馏水搅拌溶解，然后加入硫酸盐，用ＨＣｌ溶液ｐＨ为５．８－６．０，搅拌加热变性，加 热温度≤７０℃，保温≥１０分钟，再分离去杂蛋白，最后用超滤机超滤，得到超氧化物歧化酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹吉超，崔程剑，王凤山，姚凯军，
申请(专利权)人：烟台养合生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]