本发明专利技术涉及一种胰岛素结合蛋白3(IGFBP3)在制备骨缺损修复材料中的应用，利用IGFBP3上调MSCs中TβRII、TβRI和CCR2表达，激活CCR2和TβRI/II‑Smad3信号通路促进MSCs迁移的作用，在体内募集宿主MSCs至骨缺损处，为成骨提供大量前体细胞，促进骨缺损处新生骨的骨量、骨小梁数或骨密度，因此可以作为骨缺损修复材料，对骨缺损修复的治疗提供了新的方向。
The application of IGFBP3 in the preparation of bone defect repair materials
The invention relates to an insulin binding protein 3 (IGFBP3) in the preparation of the application materials to repair bone defects in the use of the expression of T beta RII and T beta RI and CCR2 IGFBP3 upregulation of MSCs, activation of CCR2 and T RI/II beta Smad3 signaling pathway to promote MSCs migration in vivo, raise the host MSCs to the bone defect and to provide a large number of precursor cells into osteoblasts, promote bone defect bone bone, trabecular bone or bone density, so it can be used as material for bone defect repair, provides a new direction for the treatment of bone defect repair.
【技术实现步骤摘要】
IGFBP3在制备骨缺损修复材料中的应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及IGFBP3在制备骨缺损修复材料中的应用。
技术介绍
肢体大段骨缺损(bonedefects)是由创伤、感染、肿瘤等因素造成的临床的常见病。据卫生部有关统计资料，在市级以上医院，骨创伤病人数量占住院病人总量的第一位。在骨创伤中，骨缺损是致残的首要因素，四肢骨折的致残率达20％～30％，是死亡原因的第五位。肢体大段骨缺损的治疗往往因为缺乏大量高成骨活性的植骨材料而使其成为难治病，经久不愈，给患者健康造成严重的损害。宿主间充质干细胞(Mesenchymalstemcell，MSCs)是中胚层中的主要干细胞，其构成了一个天然的内源性修复系统：一方面更新组织细胞；另一方面作为成骨前体细胞的主要来源分化为成骨细胞促进骨组织再生。现有的损伤修复主要策略是原位组织再生方法，即是利用自身潜力修复组织损伤。据此，当骨缺损发生时，MSCs会定向迁移、聚集、定植于损伤处(即MSCs的募集行为)，随后增殖、分化并参与损伤修复和组织再生，因此MSCs的募集对骨缺损愈合尤为重要。研究表明，趋化因子在MSCs的募集过程发挥着重要作用。MSCs的募集涉及的一个关键步骤就是MSCs的定向迁移，而迁移指的是MSCs在感受到趋化因子类物质的浓度梯度后而产生的趋向移动或运动。目前，关于胰岛素结合蛋白3(insulin-likegrowthfactorbindingprotein3，IGFBP3)的研究主要集中在调控癌细胞凋亡和增殖功能，其在IGFBP3招募骨骼系统中MSCs的作用鲜有研究，尚未见关于IGFBP3通过募集宿主MSCs促进骨组织再生，在治疗骨缺损方面的任何报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种骨缺损修复材料，为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：胰岛素结合蛋白3在制备骨缺损修复材料中的应用。本专利技术首次发现IGFBP3具有促进hBMSCs迁移，募集宿主MSCs的新功能，主要通过激活CCR2和TβRI/II-Smad信号通路，进而促进MSCs的迁移。在进一步的免疫缺陷(severecombinedimmunodeficiency，SCID)鼠股骨缺损模型实验中也证实，加载了IGFBP3的骨修复材料能募集宿主MSCs，且IGFBP3材料组骨缺损处新生骨的骨量(BV/TV),骨小梁数(Tb.N)及骨密度(BMD)均显著高于阴性对照材料组，表明了IGFBP3可以用于制备骨缺损修复材料。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次公开了将IGFBP3用于制备骨缺损修复材料，不仅拓宽了IGFBP3的应用领域，还提高了IGFBP3的应用价值，同时本专利技术方案的实施为治疗肢体大段骨缺损提供了新的方向，对肢体大段骨缺损的治疗具有重要的临床意义。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1显示了IGFBP3能够有效促进hBMSCs的迁移，****表示与对照组(Vehicle)比较p＜0.001。图2为qPCR及Westenblot验证IGFBP3对hBMSCs的TβRI/II-Smad和CCR2迁移信号通路的影响(A为IGFBP3对hBMSCs的迁移受体基因表达水平的qPCR实验结果，B为Westernblot验证IGFBP3对TβRI，TβRII和CCR2表达促进作用结果，C为Westernblot的TβRI，TβRII和CCR2表达相对密度结果，D为Westernblot验证IGFBP3对pSmad2/3和Smad2/3表达促进作用结果，E、F为Westernblot验证了抑制剂对IGFBP3上调的TβRI，pSmad2/3、Smad2/3和CCR2表达的抑制作用。G为Westernblot的TβRI，pSmad和CCR2表达相对密度结果；图中inhibitors：SB505124为TβRI/II信号通路的抑制剂，BMSCCR222为CCR2信号通路的抑制剂；**表示与对照组比较p<0.01，***表示与对照组比较p<0.005，****表示与对照组比较p<0.001。图3为TGFβ信号途径和CCR2信号途径阻断对IGFBP3引起的hBMSCs迁移的影响(****表示与对照组(Vehicle)比较p＜0.001)，SB505124为TβRI/II信号通路的抑制剂，BMSCCR222为CCR2信号通路的抑制剂。图4为加载IGFBP3的修复材料招募宿主MSCs引起骨缺损的骨再生。A为流式细胞术检测募集MSCs的细胞的Scar-1及PDGFR-α的阳性细胞点，B为在术后3、7及10天移植材料中招募的宿主MSCs的细胞百分比；C为在术后4及8周DBM，Igfbp3组的股骨缺损处再生骨组织的MicroCT的3Dand2D图；D为在术后4及8周DBM，Igfbp3组的股骨缺损处再生骨组织MicroCT的BV/TV，Tb.N及BMD结果；Scalebar:5mm；*P<0.05,**P<0.01,****P<0.001。具体实施方式下面将结合附图，对IGFBP3招募宿主MSCs以促进骨再生的作用及机制进行详细的描述，其中IGFBP3氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。实施例1、IGFBP3促进hBMSCs迁移通过Transwell法检测hBMSCs的迁移能力，确定IGFBP3对hBMSCs趋化作用的影响。Transwell法具体步骤如下：50μLhBMSCs悬液按1×104cells/chamber接种到Boydenchambersof24-wellplates(8mm，Millipore，Darmstadt，Germany)上层，不同浓度(0-10ng/ml)IGFBP3加入下层孔板中，经24小时孵育，上层小室用于迁移检测。小室经4％多聚甲醛固定后，结晶紫染色，用棉签擦去未迁移至薄膜下层的hBMSCs。迁移hBMSCs细胞数目是在光镜下(×100)五个连续视野的计数，值为三个平行样的平均计数，以迁移细胞数评价IGFBP3的迁移能力，结果见图1。结果显示，IGFBP3能够有效地促进hBMSCs的迁移，IGFBP3对hBMSCs的促迁移作用在25ng/mL最为显著。实施例2、IGFBP3通过TGFβ及CCR2信号途径促进hBMSCs迁移通过qPCR实验和Westernblot实验评价IGFBP3活化hBMSC的信号途径。qPCR实验：将hBMSCs接种于6孔细胞培养板，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，待细胞融合80％后，加入25ng/mLIGFBP3作为实验刺激组，相应地PBS作为对照组，培养1、2及3天后分别收集各组细胞，提取总RNA，按常规操作流程反转录合成cDNA，设计并合成针对细胞迁移特异基因TβRI等的Real-timePCR引物，并以GAPDH为内参，具体引物如表1所示：表1、迁移相关受体基因引物序列通过荧光实时定量PCR检测迁移相关基因的表达丰度，每组做独立实验5复孔，结果图如2中A所示。qPCR实验结果显示，25ng/mLIGFBP3处理hBMSCs2天时，CCR2和TβRI表达上调显著。Westernblot实验：将h本文档来自技高网...
【技术保护点】
胰岛素结合蛋白3在制备骨缺损修复材料中的应用。
【技术特征摘要】
1.胰岛素结合蛋白3在制备骨缺损修复材料中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述胰岛素结合蛋白3在制备促进MSCs迁移、招募MSCs归巢的材料中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓墨渊，许建中，董世武，侯天勇，罗飞，易绍萱，于博，谭玖琳，罗科宇，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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