活化的胶原骨修复材料及其专用融合活性骨修复因子制造技术

本发明专利技术公开了活化的胶原骨修复材料及其专用融合活性骨修复因子。该专用融合活性骨修复因子，是在修复因子的氨基端或羧基端融合ｖＷＦ因子的胶原结合结构域得到的融合蛋白；所述ｖＷＦ因子的胶原结合结构域是由１０－３０个氨基酸残基组成的蛋白，其保守序列为序列表中的ＳＥＱ　　ＩＤ　　№：１。活化的胶原骨修复材料，是加载有上述专用融合活性骨修复因子的胶原蛋白。本发明专利技术制备方法简便，可应用于大规模工业化生产，将在医学领域特别是骨损伤的修复中发挥巨大作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及活化的胶原蛋白骨修复支架材料及其专用融合活性骨修复因子。
技术介绍
由创伤、感染、肿瘤以及发育异常等原因造成的骨缺损是骨科临床每天都要面临的问题。人骨多形性蛋白BMP2具有很强的骨诱导活性。它是一个全长396个氨基酸残基的糖基化蛋白，包括一段由19个氨基酸残基组成的信号肽，由263个氨基酸残基组成的pro-region以及由114个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽含有7个半胱氨酸和一个N-糖基化位点，其功能形式是通过一对二硫键联系形成的同型二聚体，每个单体内的其余六个半胱氨酸形成三个链内二硫键(Wozney，J.M.et al.Novelregulators of bone formationmolecular clones and activities.Science 242，1528-34，1988)。但是天然BMP2含量很少，从人或动物骨基质中分离纯化BMP2具有很大局限性。目前，人们着重研究通过基因工程的方法制备重组BMP2，以满足临床和基础研究的需要。此外，功能类似于BMP2其它的可以诱导组织再生和创伤修复的因子还包括BMP3，PDGF，FGF，EGF，TGF，VEGF，NGF，NT3/4等。胶原材料是常用的骨修复材料。胶原是骨的主要有机成分，I型胶原及其交联纤维结构是骨细胞外基质中最丰富的蛋白。胶原结构对矿物沉积具有诱导作用，其表面含有矿物沉积的位点，可有效引发和控制矿化过程，促进骨形成并诱发至植入物中。传统的胶原载体是通过胶原分子的分子结构阻止BMP2成分弥散，维持宿主靶细胞周围的BMP2浓度，这样一方面也要求其孔径不能太大，但孔径过小又不利于成骨细胞的生长，这就需要控制一定的胶原孔径，给工艺学上带来一定难度。另一方面，使用目前的生物材料作为BMP2的载体，BMP2的用量很大，往往要达到毫克级(Kirker-Head，C.A.，Gerhart，T.N.，Armstrong，R.，Schelling，S.H.& Carmel，L.A.Healingbone using recombinant human bone morphogenetic protein 2 and copolymer.ClinOrthop Relat Res，205-17(1998)；Kokubo，S.et al.Bone regeneration byrecombinant human bone morphogenetic protein-2 and a novel biodegradablecarrier in a rabbit ulnar defect model.Biomaterials 24，1643-51(2003))。由于目前市场上BMP2很昂贵，仅sigma公司用于实验研究的BMP2，每10μg售价达500美元，国内病人很少能负担起BMP2的使用费用，另外，几毫克的BMP2，相当于从一头牛抽提的BMP2总和，而且这样大量地使用BMP2，安全性也很令人担忧。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种活化的胶原骨修复材料及其专用融合活性骨修复因子。本专利技术所提供的专用融合活性骨修复因子，是在修复因子的氨基端(N端)或羧基端(C端)融合vWF因子的胶原结合结构域(collagen binding domain，CBD)得到的融合蛋白；所述vWF因子的胶原结合结构域是由10-30个氨基酸残基组成的蛋白，其保守序列为序列表中的SEQ ID №1。所述修复因子可为BMP2、BMP3、PDGF、FGF、EGF、TGF、VEGF、NGF或NT3/4等可以诱导组织再生和创伤修复的因子，优选为BMP2。序列表中的SEQ ID №1由10个氨基酸残基组成。其中，在BMP2的N端融合vWF因子的胶原结合结构域得到的融合活性骨修复因子可具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列，序列表中的SEQ ID №2由162个氨基酸残基组成，其vWF因子胶原结合结构域的保守序列为自氨基端第22-31位氨基酸残基；编码此融合活性骨修复因子的DNA序列为序列表中的SEQ ID №3，序列表中的SEQ ID №3由486个碱基组成。上述融合蛋白可按照基因工程领域的常规方法制备。本专利技术的第二个目的是提供一种活化的胶原骨修复材料。本专利技术所提供的活化的胶原骨修复材料，是加载有上述专用融合活性骨修复因子的胶原蛋白。所述专用融合活性骨修复因子的加载量为1-4000pmol蛋白/mg胶原蛋白。本专利技术提供了一种活化的胶原骨修复材料及其专用融合活性骨修复因子。该专用融合活性骨修复因子是通过基因工程的方法在BMP2等修复因子的氨基端或羧基端融合胶原结合区CBD，以加强修复因子与胶原的结合，在修复因子与胶原蛋白之间建立一种较强的物理化学力，即可将BMP2等修复因子固定在胶原蛋白支架上，从而显著提高骨损伤的修复能力，同时也可以大大减少BMP2等修复因子的用量，并降低了使用风险。本专利技术制备方法简便，可应用于大规模工业化生产，并将在创伤修复领域特别是骨损伤的修复中发挥巨大作用。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。附图说明图1为对经纯化的表达蛋白的15％SDS-PAGE检测结果图2为对经纯化后复性的表达蛋白的15％SDS-PAGE检测结果图3为浓度逐渐递增的天然BMP2及专用融合活性骨修复因子rhBMP2-v与胶原蛋白结合量的统计结果图4为专用融合活性骨修复因子rhBMP2-v的细胞活性检测结果图5为用天然BMP2及专用融合活性骨修复因子rhBMP2-v进行的异位骨诱导实验的三个实验组包埋物的大体观察结果图6为用天然BMP2及专用融合活性骨修复因子rhBMP2-v进行的异位骨诱导实验的三个实验组大鼠植入材料的组织学切片观察结果具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、专用融合活性骨修复因子的制备及其活性鉴定一、专用融合活性骨修复因子的制备1、专用融合活性骨修复因子原核表达载体的构建根据已知的人BMP2(hBMP2)的cDNA序列(GenBank号为650)设计PCR扩增引物，并在正向引物中引入vWF因子的胶原结合结构域(CBD)“WREPSFCALS”(序列表中的SEQ ID №1)的编码序列，引物序列如下hBMP2F15’-TACCGGTAGCGCGGGCAGTGCTGCGGGTTCTGGCGGTGTCGACCAAGCCAAACAC-3’hBMP2F25’-CGCCATATGTGGCGTGAACCGAGCTTCATGGCTCTGAGCGGTACCGGTAGC-3’hBMP2R5’-CCGCTCGAGCTATTAACGACAACCACAACC-3’以人BMP2 cDNA全长为模板，在引物hBMP2F1和hBMP2R的引导下进行PCR扩增，30μl PCR反应体系为正、反向引物各1pmol/μl、dNTPs 200μmol/μl、Taq酶3ul；PCR反应条件为先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸10min。反应结束后，对扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增得到一条长度约400bp的DNA片段。对该片段进行回收并纯本文档来自技高网...

【技术保护点】
专用骨融合活性修复因子，是在修复因子的氨基端或羧基端融合ｖＷＦ因子的胶原结合结构域得到的融合蛋白；所述ｖＷＦ因子的胶原结合结构域是由１０－３０个氨基酸残基组成的蛋白，其保守序列为序列表中的ＳＥＱＩＤ№：１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈冰，戴建武，
申请(专利权)人：烟台正海生物技术有限公司，中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]