基于异位绒毛膜促性腺激素β的肿瘤基因疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于异位绒毛膜促性腺激素β的肿瘤基因疫苗，其表达载体及其宿主细胞；本发明专利技术还公开了制备该肿瘤基因疫苗的方法；本发明专利技术还公开了该肿瘤基因疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫学领域，具体涉及一种基于异位hCGβ的肿瘤基因疫苗，其制备方法，以及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
目前，恶性肿瘤已成为严重危害人类健康的重大疾病之一，在烈性传染病得到基本控制的国家，心血管疾病和肿瘤已处于死亡原因的第1和第2位。至今，肿瘤仍是人类面临的一大顽症，肿瘤的预防和治疗是医学界尚未解决的世界难题。近年发展的肿瘤免疫生物治疗是继手术治疗、放射治疗和化学药物治疗后的一种新兴疗法，其基本原理是通过多种途径激发患者的免疫系统，使之重新获得抗肿瘤的能力，在预防肿瘤的发生、转移以及手术后肿瘤的复发等方面具有独特的作用。肿瘤疫苗是肿瘤免疫生物治疗的重要手段之一。研究发现，几乎所有的恶性肿瘤细胞均能表达异位绒毛膜促性腺激素(ectopic human chor ionic gonadotrophin β.chain，ehCG.β)。分泌型ehCG具有生长因子功能、与恶性肿瘤自我生长的调控有关；而膜结合型ehCG(特别是富含负电荷糖链的自由ehCGβ链及其片段)与恶性肿瘤转移特性和恶性化程度、以及肿瘤微环境和免疫耐受的形成等有一定的关系。我们注意到，ehCG由α、β两个亚基组成，其中α亚基与促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)及促甲状腺素(TSH)的亚基基本相同；β亚基与上述糖蛋白激素也存在部分同源性，但其羧基端109-145位氨基酸残基(ehCGβ-DD37)却为ehCGβ所特有，且含多种ehCGβ特异性抗原表位，不与其它糖蛋白激素发生交叉反应，是基于ehCGβ的肿瘤疫苗的重要靶抗原。基因免疫(GeneImmunization)是将抗原蛋白的编码基因克隆于含调控元件的真核表达载体，直接注入机体后，利用在体内宿主细胞的转译系统表达相应抗原，从而诱导机体产生特异性免疫应答。与传统的蛋白疫苗相比，基因免疫不仅可有效地诱导特异性体液免疫应答，且可通过MHC I类分子途径递呈靶抗原，诱导特异性细胞免疫应答，在肿瘤的免疫生物防治中取作更重要的作用。本专利技术是基于上述考虑而进行，获得了一种以ehCGβ-DD37为靶抗原的肿瘤基因疫苗。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种以ehCGβ-DD37为靶抗原的肿瘤基因疫苗。本专利技术所要解决的技术问题还在于提供一种制备以ehCGβ-DD37为靶抗原的肿瘤基因疫苗的方法，包括a)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求1或2所述的基因序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；c)在适合所述肿瘤基因疫苗表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得所述肿瘤基因疫苗。本专利技术所要解决的技术问题还在于提供一种含有特异性ehCGβ-DD37编码基因的表达载体，以及转化有上述载体的宿主细胞。本专利技术的使用表达载体可以是真核表达载体，本专利技术使用的宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌等。作为本专利技术的一个方式，本专利技术的肿瘤疫苗含有头尾相连的四拷贝异位hCGβ远羧基端区ehCGβ-DD37的编码基因，各拷贝之间通过连接序列进行连接，其中选用的连接序列可以是编码Gly-Ser序列的基因序列，如GGATCT。作为本专利技术的一个方式，将头尾相连的四拷贝ehCGβ-DD37编码基因克隆于真核表达载体，将该重组质粒转化原核细胞，进行大量复制，大规模抽提和纯化，将获得的质粒DNA溶于一定的介质中，使其达到适宜的浓度，该DNA溶液可不添加任何免疫佐剂直接进行肌肉免疫，或采用基因枪设备进行皮内轰击等方式。其中，选用的介质可以是生理盐水或其他生物相容性组分，DNA溶液的浓度范围可以是0.5-2.0μg/μl，较优的浓度为约1.0μg/μl，每只小鼠可注射约100μl。附图说明图1显示了肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4的构建图；图2显示了肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4的DNA序列测定，其中，A图表示TR421-DD37.4的DNA测序结果，B图表示ehCGβ-DD37的DNA序列(111bp)；图3显示了肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4免疫鼠抗ehCGβ IgG水平；图4显示了肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4诱导的特异性淋巴细胞增殖活性；图5显示了肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4诱导的特异性CTL活性；图6显示了荷瘤小鼠的实体瘤，其中，A为空载质粒免疫组，B为肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4免疫鼠免疫组。具体实施例方式实施例1肿瘤基因疫苗TR421-DD37.4重组质粒的构建、鉴定及其大量纯化1.PCR法获得ehCGβ-DD37编码基因引物序列ehCGβ-DD37U5′-GAAGATCTACCTATGATGACCCCCGC-3′(SEQID NO2)和ehCGβ-DD37D5′-CGGGATCCTTGTGGGAGGATCGGGGT-3′(SEQ IDNO3)，由上海申友生物公司合成；Taq DNA多聚酶、dNTP等PCR试剂购自Biostar公司；胶回收试剂盒购自上海华舜生物公司。以pGEM3Z-hCGβ质粒(由美国专家Ross TM馈赠)。为模板、ehCGβ-DD37U和ehCGβ-DD37D为上下游引物进行PCR，PCR反应条件为反应总体积50μl，依次加入10X缓冲液5μl、25mM MgCl 23μl、10mM dNTP 1μl、10mM正反向引物各1μl、Taq酶1U、模板1μl，然后补高压三蒸水至50μl。反应程序为94℃预变性5分钟，进入PCR循环94℃变性45秒、58℃复性45秒、72℃延长1分钟，重复30个循环，最后延长10分钟。PCR DNA扩增仪为美国PerkinElmer公司出品的PE2400型PCR仪。以1％琼脂糖凝胶电泳回收ehCGβ-DD37编码基因(含111bp)。2.TR421-DD37.4重组质粒的构建与鉴定TR421-DD37.4重组质粒构建如图1所示。具体步骤如下A.基因片段和载体的酶切与回收以BamHI和BglII(TaKaRa公司产品)对ehCGβ-DD37编码基因的PCR回收产物进行双酶切，以BglII对TR421质粒(上海普飞生物技术有限公司代理invitrogen公司产品)进行单酶切，具体方法如下在小于1μg的质粒DNA或PCR回收产物中加入2U相应内切酶、2μl相应缓冲液，加双蒸水至20μl，37℃反应1～24小时，65℃终止反应，以1％琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物。B.酶切载体与酶切基因片段的连接取适量酶切载体和目的片段加入反应管，使载体和片段的摩尔数之比为1∶3，然后加1μlT4 DNA连接酶(MBI公司产品)、1μl缓冲液，补双蒸水至10μl，混合后置16℃反应1小时或4℃过夜。C.连接产物转化宿主细菌a.菌种的复苏取-70℃保存菌种DH5α，迅速挑取少许冰冻样菌种于2ml LB液体培养基中，以280rpm的速度在37℃摇床中振荡培养6-8小时，而后接种于LB琼脂平板上，置于37℃孵箱中培养。b.感受态DH5α制备取-70℃保存菌种，迅速挑取少许冰冻样菌种于2ml LB液体培养基中，以280rpm的速度在37℃摇床中振荡培养6-8小时，而后接种于LB琼脂平板上，置于37℃孵箱中培养。挑选新鲜单个菌落接种于2ml LB培养液中，37℃摇床培养过夜，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于异位绒毛膜促性腺激素β的肿瘤基因疫苗，含有至少１拷贝的ＳＥＱＩＤＮＯ：１结构的基因序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：熊思东，王立新，储以微，
申请(专利权)人：上海欣安基因免疫与疫苗研究开发有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]