用于破碎组织材料的组合物和方法技术

本发明专利技术涉及一种用于破碎组织材料的组合物，所述组合物包含与至少一种用于酶裂解的酶和至少一种离液剂相组合的固体破碎粒子，本发明专利技术还涉及一种通过同时应用机械研磨或碾磨破碎和酶消化来破碎组织材料的方法。

Composition and method for breaking tissue materials

The invention relates to a composition for broken tissue material, comprising at least one and for enzymatic cleavage of the enzyme and at least one chaotropic agent combination of solid particles, the invention also relates to a method for the simultaneous application of mechanical grinding or crushing grinding and enzyme digestion to break tissue material.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于破碎组织材料的组合物和方法描述：前言：本专利技术涉及用于破碎组织样品例如特别是固体组织的组合物，其中所述组合物包含与至少一种用于酶裂解的酶和至少一种离液剂相组合的固体破碎粒子，用于通过同时的机械研磨或碾磨破碎和酶消化进行的组合破碎处理。此外，本专利技术涉及通过同时应用机械研磨或碾磨破碎和酶消化来破碎固体组织材料的方法。本专利技术还涉及用于按照本专利技术进行固体组织破碎的试剂盒和系统。
技术介绍
：在涉及从完整样品分开、分离和分析所需组分(被分析物)的分析性研究中，特别是在细胞组分例如核酸、RNA、DNA、蛋白质和其他生物化学被分析物的分离/收获和分析中，样品材料的破碎步骤是首先和基础性步骤之一。原则上，化学和机械/物理方法两者都可用于生物样品的破碎。对于许多样品类型例如大肠杆菌(E.coli)和培养的细胞来说，化学方法通常是优选的。依赖于研磨、剪切、击打和冲击的机械/物理方法一般用于不能通过化学处理有效破碎的生物样品，例如许多微生物、固体组织、固体样本(例如种子)。已知的化学破碎方法通常利用在去污剂、表面活性剂、裂解酶或离液剂基础上的所谓的裂解溶液或裂解缓冲剂，其破坏生物样品或细胞的结构以释放出细胞内含物或被分析物。机械或物理破碎方法通常利用均质机、研钵和研杵、超声发生器、混合器、磨机和涡旋振荡器，其通过研磨、剪切、击打和冲击力来机械破坏生物样品的结构，以释放出细胞内含物或被分析物。破碎和均质化方法的选择强烈依赖于待处理的生物样品的种类以及待分离和分析的细胞组分，并且工具、化学品和它们的使用方法的选择可能对分析结果具有显著影响。到目前为止，固体组织材料通常通过应用上面提到的几个机械破碎技术步骤或通过在长时间段内应用化学(即酶)消化(通常为过夜消化)进行均质化或破碎。然而，这些方法耗时且需要特殊的高性能混合装置才能实现适合的均质化和充分裂解，因此常常使分离到的敏感被分析物劣化。已发现，使用低功率混合器例如涡旋振荡器的研磨对于研磨固体组织材料来说不太有效。使用化学破碎方法例如裂解缓冲剂与机械破碎方法的组合已被非常一般性地提到，例如在D.W.Burden的“生物样品破碎指南——2012年(GuidetotheDisruptionofBiologicalSamples–2012)”(RandomPrimers,IssueNo.12,pages1-25,2012)中，所述文献提供了关于应用于各种不同生物样品的破碎的各种不同的化学和机械破碎方法的广泛综述。该出版物没有解决所述各种不同的化学和机械方法中的哪些特定破碎方法可以被组合或对于特定生物样品类型来说如何组合(例如在后续的处理步骤中或同时)。提到了使用研磨球和涡旋振荡器来破裂组织，但是指出了由于性能不良，涡旋振荡器不太适合于研磨组织材料(不太有效)。在对生物样品进行预处理以释放出所需被分析物的领域中，各种不同的均质化组合物或裂解试剂是已知的。例如，在WO2014/096136A2、EP2447352A1或WO1999/33559A1中提到了均质化介质，其可以包含裂解酶和机械碾磨粒子。所有这些介质被描述为用于单细胞、细胞培养物、微生物、细菌、病毒或孢子的破碎。本申请人的国际申请WO2002/00600A1涉及一种用于分离和稳定微生物例如原核生物、真菌、原生动物或藻类中的核酸或来自于所述微生物的核酸的方法。其中，一般性提到了通过使用机械、化学、物理或酶方法可以均质化或破碎紧实的生物样品。在实施例5中描述了细菌样品的细胞破碎，并且在其中提到了使用酶裂解(溶菌酶介导的细胞破碎)，在以30Hz的混合速度使用带有直径为150至600μm的玻璃珠的珠磨机5分钟的支持下，来破碎细菌的细胞壁。国际申请WO2011/144304A1涉及用于身体样品的裂解的裂解缓冲剂和方法。其中要求保护的裂解缓冲剂除了包含至少一种离液剂和至少一种还原剂之外，还包含至少一种蛋白水解酶。所述裂解缓冲剂还可以包含珠磨粒子，并且其中描述的用于处理身体样品的方法包括对包含所述身体样品和具有至少一种蛋白水解酶的裂解缓冲剂的混合物进行珠磨。所述申请具体涉及与呼吸疾病的诊断相关的身体样品，并且其中所述身体样品被定义为包含体液或半流体样品例如痰液、脓、分泌物、吸出物、灌洗液、拭子，或非呼吸系统样品例如血液、脓、胸膜液、胸膜穿刺物、胃液、胃吸出物、引流物或穿刺液。所述裂解缓冲剂主要旨在用于破碎呼吸系统样品，并且强制性包含用于溶解这些样品中的粘液成分的还原剂。本申请人的EP2166335A1描述了一种高性能珠磨装置和使用这种装置破碎固体组织样品的方法。实施例提到，将机械破碎的组织样品随后按照DNeasy流程(可以从Qiagen获得)用蛋白酶K和核糖核酸酶A处理，用于进一步分析。WO2005039722A2和相应的US8,020,790描述了通过使用特定碾磨粒子和未进一步指定的裂解缓冲剂来破碎生物样品。Ciccone等人在他们的科学出版物“B细胞靶向病毒通过提高整体5-羟甲基胞嘧啶水平破坏淋巴组织中潜在保护性的基因组甲基化模式(AB-celltargetingvirusdisruptspotentiallyprotectivegenomicmethylationpatternsinlymphoidtissuebyincreasingglobal5-hydroxymethylcytosinelevels)”(VeterinarysResearch2014,45,108)中描述了用于DNA印迹分析的组织破碎，其使用10mm玻璃珠和10mMtris,pH8.0,100mMNaCl,10mMEDTA,0.5％SDS。在其中添加100ug蛋白酶K并在50℃下静置过夜，用于蛋白质消化。Mann和Babb在他们的科学出版物“妊娠大鼠中的神经甾类激素受体基因表达(Neuralsteroidhormonereceptorgeneexpressioninpregnantrats)”(MolecularBrainResearch2005,142,39-46)中描述了一种脑组织样品均质化方法，其使用含有蛋白酶K的裂解缓冲剂和两个4mm研磨珠，并且在56℃下进行蛋白质消化30分钟，然后在-20℃下进行30分钟。如上所示，用于生物样品的同时破碎的裂解酶与机械破碎粒子的特定组合，只是被描述用于表现出以相对小的尺寸(微生物、细胞、病毒等)为特征或结构上“脆弱”(单细胞、细胞培养物、体液)的生物结构的生物样品材料。相反，固体组织材料通常以相对稳定的细胞构造或纤维状或膜状结构为特征，并且与例如流体或半流体样品相比，紧实得多。因此，与在上面的现有技术中所描述的较小和“较脆弱”的样品材料(例如细胞、细胞培养物、微生物、细菌、病毒或孢子)相比，固体组织材料表现出提高的机械强度或完整性，更高的密度，并且常常以大得多的完整/紧密连接的或紧实的样品碎片的形式提供或取样。不言而喻，这些固体组织材料原则上需要以完全不同的方式处理，以破碎并释放出所需被分析物。与破碎流体样品或细胞培养物样品相比，破碎相对紧密的细胞结构要求更强的力和更长的消化时间。于是，施加强的机械或化学破碎力带来使通常非常敏感的所需被分析物例如核酸、DNA、RNA和其他细胞组分损坏或劣化的风险。专利技术目的：本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于破碎固体组织材料的组合物，所述组合物包含：‑一种或多种固体破碎粒子；‑至少一种用于酶裂解的酶；‑总浓度等于或小于1M的至少一种离液剂；以及优选地‑至少一种缓冲剂；并且所述组合物不包含使所述酶变性或失活的量的醇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.27 EP 15169321.51.一种用于破碎固体组织材料的组合物，所述组合物包含：-一种或多种固体破碎粒子；-至少一种用于酶裂解的酶；-总浓度等于或小于1M的至少一种离液剂；以及优选地-至少一种缓冲剂；并且所述组合物不包含使所述酶变性或失活的量的醇。2.权利要求1的组合物，其还包含选自下述的一种或多种试剂：-至少一种表面活性剂，优选地选自非离子型表面活性剂；-至少一种核酸酶抑制剂；-至少一种消泡剂；-至少一种渗透压稳定剂；-至少一种还原剂；及其混合物。3.前述权利要求任一项的组合物，其还包含所述用于酶裂解的酶之外的至少一种其他酶，优选为核糖核酸酶。4.前述权利要求任一项的组合物，其中所述至少一种用于酶裂解的酶选自蛋白酶，优选为蛋白酶K。5.前述权利要求任一项的组合物，其中所述组织材料选自人类和动物来源的固体组织。6.前述权利要求任一项的组合物，其中所述至少一种离液剂是盐酸胍。7.前述权利要求任一项的组合物，其中所述固体破碎粒子表现出至少1mm的尺寸。8.权利要求7的组合物，其中所述固体破碎粒子表现出>2mm的尺寸。9.权利要求7或8的组合物，其中所述固体破碎粒子表现出≥3mm的尺寸。10.一种用于破碎组织材料的试剂盒，所述试剂盒包含：-一种或多种固体破碎粒子；-至少一种用于酶裂解的酶；-至少一种缓冲剂；-总浓度等于或小于1M的至少一种离液剂；以及任选地，选自下述的一种或多种试剂：-至少一种表面活性剂；-至少一种核酸酶抑制剂；-至少一种消泡剂；-至少一种渗透压稳定剂；-至少一种还原剂；-所述用于酶裂解的酶之外的至少一种其他酶，优选为核糖核酸酶；-至少一种有机溶剂，优选为醇；以及-任选地，用于接收所述组织材料的容器；-以及带有用于处理所述组织材料的说明书的小册子。11.一种系统，其包含权利要求1至9任一项中所定义...

【专利技术属性】
技术研发人员：多尼米克·奥尼尔，丹耶·斯普尔灵，斯蒂芬尼·施罗耶尔，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE