丝状真菌来源的赖氨酰氧化酶制造技术

本发明专利技术提供丝状真菌来源的赖氨酰氧化酶及编码它的ＤＮＡ。由以下（ａ）或（ｂ）的蛋白质组成的赖氨酰氧化酶：（ａ）具有序列号２中所示氨基酸序列的蛋白质；（ｂ）具有序列号２中所示氨基酸序列经部分改变的氨基酸序列、能作为赖氨酰氧化酶发挥作用的蛋白质。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及丝状真菌来源的赖氨酰氧化酶及编码它的DNA，及其应用。
技术介绍
丝状真菌中尤其是包含米曲霉(黄色曲霉属)等的曲霉在日本传统上用于酿造业，制备清酒、豆酱、酱油、米酒(mirin)等，是可直接食用的菌类，是美国FDA(食品及药物管理局)归属到GRAS(GenerallyRecognized as Safe)的安全的基因来源。普通真菌来源的基因用到食品时所进行的必要的慢性毒性检查等安全审查时，普通真菌来源的基因大约花费10亿日元，与此相对，上述GRAS级别的基因具有这样的优点其花费大约是普通真菌的1/3，并且审查花费的时间也短。因此，从安全性和经济性观点来看，可以说丝状真菌尤其是曲霉是利用价值极高的基因宝库。与本专利技术相关的技术公开在下述文献中。专利第2796114号公报(专利文献1)，专利第2977245号公报(专利文献2)。专利技术公开通过阐明这些真菌基因组DNA信息，阐明其编码的基因等的功能，可如利用生物技术的物质生产那样，在食品生产中提供安全基因资源的有效应用方法，在农药及医药领域提供对各种基因筛选有用的信息。此外，还可提供分析黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)等近源谷物污染菌、人感染菌的基因组信息有用的工具。为了上述课题本专利技术者们进行了研究，结果成功地分析了米曲霉(曲霉菌的一种)的基因组，确定出其碱基序列(及其编码的氨基酸序列)及其各种功能等。在所得结果基础上，本专利技术公开了原专利(专利2001-403261)中米曲霉来源的各种DNA，以及由这些DNA制备的核苷酸序列组成的扩增GRAS级别的丝状真菌基因用的引物及检测丝状真菌基因用的探针。本专利技术者们以所得曲霉菌基因组信息为基础进行了进一步研究。即，本专利技术者们注意到赖氨酰氧化酶，从所得碱基序列中确定出编码赖氨酰氧化酶的序列，另外还尝试确定该序列编码的蛋白质的氨基酸序列。另外，赖氨酰氧化酶是胺氧化酶的一种，通过氧化蛋白质中的赖氨酸残基而使赖氨酸残基间形成交联。很久以来人们知道存在动物来源的赖氨酰氧化酶，赖氨酰氧化酶通过蛋白质间的交联作用而用于提高食感(例如参照上述专利文献1和2)。近年来人们对微生物来源的赖氨酰氧化酶有所研究，从巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)来源的赖氨酰氧化酶与哺乳动物来源的具有类似的底物特异性(FEBSLett.1988，238，74-76)。人们发现毕赤酵母来源赖氨酰氧化酶不仅与哺乳动物来源的性质相似，而且与细菌类，如大肠杆菌(Escherichiacoli)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)等的胺氧化酶具有类似的结构(J Inorg Biochem.2001，83(2-3)193-204)。但是，到目前为止尚没有从与酵母同为高等微生物的丝状真菌成功分离赖氨酰氧化酶的报道。本专利技术者们进行了认真研究，结果在曲霉菌的基因组中成功发现了与已报道的巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)来源的赖氨酰氧化酶基因同源性高的序列。当用丝状真菌为宿主表达该序列编码的蛋白质时显示赖氨酰氧化酶活性。由该结果可实验性确认该序列编码赖氨酰氧化酶。另一方面，成功确定了该序列中的编码区域，发现该下列编码的蛋白质具有新型的氨基酸序列。如此，本专利技术者们首次成功鉴定了丝状真菌来源的赖氨酰氧化酶基因及其氨基酸序列。本专利技术是在以上结果的基础上完成的，本专利技术中具体的课题是提供丝状真菌来源的赖氨酰氧化酶及编码它的DNA，以及该丝状真菌来源的赖氨酰氧化酶的生产方法。为了解决上述课题，提供以下配置由以下(a)或(b)的蛋白质组成的赖氨酰氧化酶(a)具有序列号2中所示氨基酸序列的蛋白质； (b)具有序列号2中所示氨基酸序列经部分改变的氨基酸序列、能作为赖氨酰氧化酶发挥作用的蛋白质。以下(A)或(B)的DNA(A)编码中记载的赖氨酰氧化酶的DNA；(B)在严紧条件下与(A)中的DNA杂交，其编码的蛋白质能作为赖氨酰氧化酶发挥作用的DNA。具有以下(i)-(iii)中任一序列的DNA(i)序列号3中所示碱基序列；(ii)序列号4中所示碱基序列；(iii)序列号5中所示碱基序列；(iv)序列号6中所示碱基序列；(v)序列号1中所示碱基序列；(vi)序列号7中所示碱基序列。携带或中DNA的载体。外源导入了或中DNA的丝状真菌。包括下面步骤(1)和(2)的赖氨酰氧化酶的生产方法(1)在可能产生前述DNA编码的蛋白质的条件下培养中丝状真菌的步骤，及(2)回收产生的蛋白质的步骤。本专利技术中的“DNA”不限于双链，还包括构成它的单链DNA(正义链和反义链)。另外，本专利技术的DNA包含考虑到简并密码子的任意碱基序列。而且其形式也不限定，包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。本专利技术中“编码蛋白质的DNA”是指当表达该DNA时能获得该蛋白质的DNA，具有与该蛋白质的氨基酸序列相对应的碱基序列的DNA自不用说，它还包括向上述DNA中添加了不编码氨基酸序列的序列的DNA(例如，包含1个或多个内含子的DNA)。本专利技术中“丝状真菌来源的赖氨酰氧化酶”是指以丝状真菌为原始材料制备的赖氨酰氧化酶，或者在获得的过程中利用丝状真菌保持赖氨酰氧化酶的信息(氨基酸序列和DNA序列而制备的赖氨酰氧化酶，它不仅包括用物理方法和化学方法等从丝状真菌制备出的赖氨酰氧化酶，而且包括利用基因工程学技术用本专利技术中公开的赖氨酰氧化酶的氨基酸序列或DNA序列而制备的赖氨酰氧化酶。附图简述附图说明图1是载体pBALO的构建程序模式图。图2表示用载体pBALO转化的丝状真菌进行赖氨酰氧化酶活性测定的结果表(上部分)和图(下部分)。ABPU1表示对照(应用构巢曲霉ABPU1株的培养上清的样品)。图3是以从携带赖氨酰氧化酶基因的转化体中提取的RNA为模板，用该基因特异的引物扩增的3’DNA片段的序列。下划线部分表示使用引物(LO-3’)的位置。图4是载体pBALO-D的构建程序模式图。图5表示用载体pBALO-D转化的丝状真菌进行赖氨酰氧化酶活性测定的结果表(上部分)和图(下部分)。ABPU1表示对照(应用构巢曲霉ABPU1株的培养上清的样品)。实施专利技术的最佳状态(蛋白质)本专利技术的第1方面涉及丝状真菌来源的赖氨酰氧化酶。本专利技术提供的赖氨酰氧化酶由例如具有序列号2中氨基酸序列的蛋白质组成。如后述的实施例所示，应用丝状真菌的表达体系，可证实该蛋白质确实显示赖氨酰氧化酶活性。这里，通常对某种蛋白质的氨基酸序列实施部分改变时，改变后的蛋白质与改变前的蛋白质具有同等的功能。即，氨基酸序列的改变基本上对蛋白质的功能无影响，改变前后能维持蛋白质的功能。考虑到这一点，部分改变上述具有赖氨酰氧化酶活性的蛋白质的氨基酸序列(序列号2)，即便是拥有改变氨基酸序列的蛋白质(以下，叫做“改变蛋白质”)只要其具有赖氨酰氧化酶功能也可构成本专利技术的赖氨酰氧化酶(蛋白质)。换言之，只要是能维持赖氨酰氧化酶的功能允许部分氨基酸的改变。另外，优选改变前后赖氨酰氧化酶的活性未降低，但多少有些变动(上升或降低)也可以。这里所讲的“氨基酸序列的一部分可以被改变”指氨基酸序列中1个或多个氨基酸被删除、替换、添加和/或插入。只要是能维持赖氨酰氧化酶的本文档来自技高网...

【技术保护点】
由以下（ａ）或（ｂ）的蛋白质组成的赖氨酰氧化酶：（ａ）具有序列号２中所示氨基酸序列的蛋白质；（ｂ）具有序列号２中所示氨基酸序列经部分改变的氨基酸序列、能作为赖氨酰氧化酶发挥作用的蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：结城健介，东本笃树，町田雅之，阿部敬悦，五味胜也，浅井洁，佐野元昭，金大心，长崎英树，细山哲，秋田修，小笠原直毅，久原哲，
申请(专利权)人：独立行政法人产业技术综合研究所，独立行政法人制品评价技术基盘机构，独立行政法人酒类综合研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]