一种L‑乳酸催化反应体系及L‑乳酸的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种L‑乳酸催化反应体系及L‑乳酸的制备方法，所述L‑乳酸催化反应体系含有葡萄糖脱氢酶、二羟酸脱水酶、2‑酮‑3‑脱氧葡萄糖酸醛缩酶、甘油醛脱氢酶和L‑乳酸脱氢酶，利用所述反应体系的5个酶，以葡萄糖为原料，在一个反应器中进行级联酶促催化反应即可得到L‑乳酸，不需要添加ATP。

A preparation method of L lactic acid catalytic reaction system and L lactic acid

【技术实现步骤摘要】
一种L-乳酸催化反应体系及L-乳酸的制备方法
本专利技术涉及L-乳酸的酶催化生产领域，尤其是一种L-乳酸催化反应体系及L-乳酸的制备方法。
技术介绍
乳酸又名α-羟基丙酸，因含一个不对称碳原子，分为D-乳酸和L-乳酸。乳酸在食品、医药、生物降解塑料和化妆品行业有较好的应用。乳酸在食品业中的应用主要是作为酸味剂的使用，并且在酿造工业作为抑菌剂和风味调节剂使用。乳酸在医药行业可以直接配制成药，而乳酸盐可作为消毒剂使用。因为L-乳酸中含有羟基和羧基，因此有自动酯化能力，脱水聚合成聚L-乳酸，高度光学异构的聚L-乳酸在骨外科、人造手术缝合线、血管外科及药物缓释材料方面都有良好的应用前景。经研究发现，以乳酸为原料合成的乳酸聚合物具有较好的生物降解性，因此可以作为新型环保材料，具有广泛的市场前景，也符合我国可持续发展，建设环境友好型社会的战略和理念。因为乳酸的钠盐和钙盐具有较好的保湿效果，并且可以改善皮肤组织结构，因此乳酸在化妆品行业有着广泛的应用。到目前为止，乳酸的生产方法主要有发酵法、化学合成法和酶法。发酵法主要是以糖源为底物通过菌体代谢生产乳酸，主要有同型和异型乳酸菌发酵，因为乳酸菌对生长环境的要求苛刻，反应过程不易控制，成为发酵法生产乳酸的限制因素。化学合成法生产乳酸主要有乳腈法、丙烯腈法和丙酸法。以乳腈法为例，该法是以乙醛和氢氰酸为原料，经过粗乳酸、蒸馏提纯、浓硫酸水解等步骤生产乳酸，生产过程产生大量的有毒有害物质，对环境危害较大，不利于可持续发展。酶法主要有氯丙酸酶法转化和丙酮酸酶法转化。氯丙酸酶法是以DL-2-氯丙酸为底物生产L或D-乳酸，该法底物较贵不易于工业化生产。因此需要开发一种投资成本低，转化率高，无污染的新型生产方式进行乳酸的生产。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种L-乳酸催化反应体系。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供应用上述L-乳酸催化反应体系的L-乳酸的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种L-乳酸催化反应体系，含有葡萄糖脱氢酶、二羟酸脱水酶、2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶、甘油醛脱氢酶和L-乳酸脱氢酶。优选地，上述L-乳酸催化反应体系，每1mL反应体系中酶的添加量为：1U/mL的葡萄糖脱氢酶，2U/mL的二羟酸脱水酶，1U/mL的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶，1U/mL的甘油醛脱氢酶，1U/mL的L-乳酸脱氢酶。上述L-乳酸催化反应体系中的任何一种酶还可以为任何一种具有同等功能的酶所替换。利用上述反应体系所提到的5个酶，以葡萄糖为原料，在一个反应器中进行级联酶促催化反应得到L-乳酸，具体反应过程为：由葡萄糖脱氢酶(Glucosedehydrogenase，EC1.1.1.47)催化葡萄糖生成葡萄糖酸；由二羟酸脱水酶(Dihydroxyaciddehydratase，EC4.2.1.9)催化葡萄糖酸生成2-酮-3-脱氧葡萄糖酸；由2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶(2-keto-3-desoxygluconatealdolase，EC4.1.2.14)将2-酮-3-脱氧葡萄糖酸转化为甘油醛和丙酮酸；由甘油醛脱氢酶(Glyceraldehydedehydrogenase，EC1.2.1.3)催化甘油醛生成甘油酸；由二羟酸脱水酶(Dihydroxyaciddehydratase，EC4.2.1.9)催化甘油酸生成丙酮酸；再由L-乳酸脱氢酶(L-lactatedehydrogenase，EC1.1.127)催化丙酮酸生成L-乳酸。优选地，上述L-乳酸的制备方法，所述多酶反应体系还含有以下各成分：辅酶NAD+，缓冲液和二价镁离子。优选地，上述L-乳酸的制备方法，缓冲液为HEPES缓冲液。优选地，上述HEPES缓冲液浓度为50-400mM，pH值7.0；二价镁离子浓度为5mM。本专利技术的有益效果：所述L-乳酸催化反应体系在一个多酶反应体系中，不需要添加ATP，通过体外多酶催化，将葡萄糖转化为L-乳酸。由于最后一步L-乳酸脱氢酶催化的反应为不可逆反应，理论上L-乳酸具有很高得率。我们通过过程优化，确定了多酶反应途径中酶和辅酶的用量，缓冲液的类型和浓度，使L-乳酸的得率接近理论值。所述L-乳酸的制备方法具有操作简便，原料利用率高、L-乳酸产率高，生产成本低，无污染等优点，可以实现L-乳酸的规模化生产。附图说明图1为葡萄糖转化生成L-乳酸的体外多酶催化途径的示意图；其中，GDH，葡萄糖脱氢酶；DHAD，二羟酸脱水酶；KDGA，2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶；ALDH，甘油醛脱氢酶；L-LDH，L-乳酸脱氢酶。图2为SDS-PAGE检测酶的表达与纯化图，SDS-PAGE检测5个关键酶，其中，SsGDH葡萄糖脱氢酶来源于Sulfolobussolfataricus；SsDHAD二羟酸脱水酶来源于Sulfolobussolfataricus；SacKDGA2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶来源于Sulfolobusacidocaldarius；TaALDH甘油醛脱氢酶来源于Thermoplasmaacidophilum；TmLDH来源于Thermotogamaritima；T，大肠杆菌细胞裂解液；S，裂解液上清；H，经热处理的裂解液上清；Ni，经镍柱纯化的酶。图3为乳酸以及中间产物的检测图，其中，Glucose，葡萄糖；Gluconate，葡萄糖酸；Glyceraldehyde，甘油醛；Glycerate，甘油酸；Pyruvate，丙酮酸；Lactate，乳酸。葡萄糖的出峰时间在9.346分钟，葡萄糖酸的出峰时间在9.322分钟，甘油醛的出峰时间在11.633分钟，甘油酸的出峰时间在11.031分钟，丙酮酸的出峰时间在9.818分钟，L-乳酸的出峰时间在12.971分钟。图4为初始反应条件下L-乳酸的产量与产率。其中■代表葡萄糖含量随时间的变化；●代表乳酸的产量随时间的变化；代表乳酸对葡萄糖的转化率。图5为反应体系中所需酶添加量的优化。图A为葡萄糖脱氢酶添加比例的优化，图B为葡萄糖酸脱水酶添加比例的优化，图C为2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶添加比例的优化，图D为甘油醛脱氢酶添加比例的优化，图E为L-乳酸脱氢酶添加比例的优化。图6为反应体系中所需辅酶NAD+添加量的优化。图7为反应体系中所需缓冲液浓度的优化。图8为反应体系中所需缓冲液类型的优化。图9为在优化的反应体系条件下L-乳酸的产量与产率。其中■代表葡萄糖含量随时间的变化；●代表乳酸的产量随时间的变化；代表乳酸对葡萄糖的转化率。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术所述技术方案作进一步的说明。除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。实验材料D-glucose,Sigmaaldrich公司产品，产品编号：V900392；NAD+，Sigmaaldrich公司产品，产品编号：N3014；pET20b，pET28a载体，Novagen，Madison，WI；大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；本专利技术中的所有酶都可以按照基因工程方法通过原核表达获得；实验例1.体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种L‑乳酸催化反应体系，其特征在于：含有葡萄糖脱氢酶、二羟酸脱水酶、2‑酮‑3‑脱氧葡萄糖酸醛缩酶、甘油醛脱氢酶和L‑乳酸脱氢酶。

【技术特征摘要】
1.一种L-乳酸催化反应体系，其特征在于：含有葡萄糖脱氢酶、二羟酸脱水酶、2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶、甘油醛脱氢酶和L-乳酸脱氢酶。2.根据权利要求1所述的L-乳酸催化反应体系，其特征在于：每1mL反应体系中酶的添加量为：1U/mL的葡萄糖脱氢酶，2U/mL的二羟酸脱水酶，1U/mL的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶，1U/mL的甘油醛脱氢酶，1U/mL的L-乳酸脱氢酶。3.根据权利要求1所述的L-乳酸催化反应体系，其特征在于：所述L-乳酸催化反应体系中的任何一种酶还可以为任何一种具有同等功能的酶所替换。4.一种L-乳酸的制备方法，其特征在于：利用权利要求1所述反应体系的5个酶，以葡萄糖为原料，在一个反应器中进行级联酶促催化反应得到L-乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：游淳，徐淑霞，谢雷朋，张以恒，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12