在植物中获得病原体抗性的方法技术

本发明专利技术涉及通过降低ＮＡＤＰＨ氧化酶的表达、活性或功能，在植物中产生或增强病原体抗性的方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在植物中通过降低NADPH氧化酶表达、活性或功能用于产生或增强病原体抗性的方法。植物生物技术工作的目标是产生具有有益新特性的植物，例如用于增强农业生产力。植物对病原体的天然防御机制常常是不足的。单真菌病每年导致数十亿美圆的损失。自植物、动物或微生物来源导入外源基因可增强防御性。实例为通过表达苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素保护免受对通过昆虫摄食的损害(Vaeck等人(1987)Nature 32833-37)或通过表达大豆几丁质酶保护免受真菌感染(Broglie等人，(1991)Science2541194-1197)。然而，大部分描述的方法只对单一病原体或狭窄范围的病原体提供抗性。只存在几种使植物对较广谱病原体具有抗性的方法。系统性获得抗性(SAR)-在多种植物病原体相互作用中的防御机制—可通过应用内源性信号物质如茉莉酸(JA)或水杨酸(SA)进行提供(Ward等人，(1991)Plant Cell 31085-1094；Uknes等人(1992)Plant Cell 4(6)645-656)。通过合成化合物如2，6-二氯异烟酸(INA)或S-甲基苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸酯(BTH；Bion)可达到相似作用(Friedrich等人(1996)Plant J 10(1)61-70；Lawton等人(1996)Plant J.1071-82)。在SAR的情况下具有正调节作用的发病机理相关(PR)蛋白质的表达在一些情况下也可引起病原体抗性。在大麦中，Mlo基因座描述为对病原体防御的负调节物。Mlo基因的缺失引起对大多数霉病物种的抗性增加，并尤其是为种非特异抗性(Büschges R等人(1997)Cell 88695-705；Jorgensen JH(1977)Euphytica2655-62；Lyngkjaer MF等人，(1995)Plant Pathol 44786-790)。通过常规育种获得的Mlo缺陷大麦变种在农业中已正在进行应用。尽管精耕细作，可能由于隐性的事实，已证实抗性是持久的。对在其它植物中，特别是谷类物种中的Mlo样抗性没有进行描述。已对来自其它谷类物种中的Mlo基因及多种同源物(homolog)进行鉴定并克隆(Büschges R等人(1997)Cell 88695-705；WO98/04586；Schulze-Lefert P；Vogel J(2000)Trends Plant Sci.5343-348)。已对用这些基因用于获得病原体抗性的多种方法进行了描述(WO98/04586；WO00/01722；WO99/47552)。缺点是Mlo介导的防御机制包含叶细胞的自发相继死亡(Wolter M等人(1993)Mol Gen Genet 239122-128)。另一个缺点是Mlo缺陷基因型显示对半活体营养(hemibiotrophic)病原体如(稻瘟病菌(Magnaporte grisea；M.grisea))及禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus(蠕孢菌(Bipolarissorokiniana))的超敏反应(Jarosch B等人(1999)Mol Plant MicrobeInteract 12508-514；Kumar J等人(2001)Phytopathology 91127-133)。将活性氧类(ROS；例如过氧化物(O2-)、羟基自由基及H2O2)的释放归于对植物病原体的反应中有重要的保护功能(Wojtaszek P(1997)Biochem J 322681-692)。细胞如何产生ROS的多种途径是已知的。在哺乳动物的巨噬细胞中，必需提及的特别是可转移电子到分子氧的酶NADPH氧化酶。在植物中，也已对其同源酶进行了鉴定(Lamb & Dixon(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48251)。已显示在拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)NADPH氧化酶的催化亚单位中的突变显示活性氧中间体(ROI)的积累降低。对于超敏反应(HR)，结果是不同的用无毒力及细菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)显示在双重突变体中HR降低，而毒力卵菌寄生霜霉菌(Peronosporaparasitica)显示HR升高。然而，与野生型植物相比，毒力及无毒力丁香假单胞菌菌株的生长均未发生变化(Torres MA等人(2002)Proc Natl AcadSci USA 99517-522)。同样，通过用生理相关浓度的抑制剂氯化二亚苯基碘(DPI)抑制NADPH氧化酶对病原体性真菌的发育无作用(Hückelhoven R & Kogel KH(1998)Mol Plant Microbe Interact 11292-300)。吞噬细胞的大麦NADPH氧化酶(pNAox，吞噬细胞NADPH氧化酶的大亚单位gp91phox的同源物)的cDNA片段在基因库登录号AJ251717)下进行了描述。本专利技术的目的是提供用于在植物中防御病原体的新化合物，所述化合物在许多尽可能的不同植物物种，优选在农业中应用的农作物植物中引起对尽可能广泛病原体谱的有效防御。我们已发现通过本专利技术方法已达到本目。本专利技术的第一个方面包括用于在植物中对至少一种病原体产生或增强抗性的方法，所述方法包括以下操作步骤a)降低在植物或其组织、器官、部分或细胞中NADPH氧化酶的蛋白质量、活性或功能，及b)与起始植物相反或相比，选择其中对至少有一种病原体存在抗性或抗性增强的植物。令人惊讶的是，通过用双链pNAox-dsRNA(“基因沉默”)序列特异RNA干扰方法降低大麦NADPH氧化酶(pNAox)在表皮细胞中的表达，显示Bgh感染后疾病水平显著降低(参考Haustoria的公式进行测定)。这个发现特别令人惊讶，因为与NADPH氧化酶相关的活性氧类(“氧化进发”)的释放一般归于保护性功能。与Mlo相似，NADPH氧化酶表达的降低介导对多种禾谷类白粉菌大麦专化型(Blumeria graminis f.sp.hordei)分离株的广泛抗性。在瞬时基因沉默实验中，Bgh(吸器发育)的穿透率显著降低35％以上—其强度作用与通过Mlo-dsRNA获得的作用相对应(Schweizer P等人(2000)PlantJ 24895-903)。在野生型大麦变种Pallas中，大约40％真菌穿透导致吸器的发育，通过导入NADPH氧化酶的双链RNA(pNAox-dsRNA)在NADPA氧化酶表达降低的情况下穿透率只达到大约25％。甚至在病原体敏感野生型变种如Pallas中，只可观察到大约40至50％的穿透率的事实，可归因于一直存在的基础抗性。由于这些发现，可认为酶NADPH氧化酶是用于病原体如Bgh成功穿透入植物细胞的主要元件。此外，此方法优于所有一般通过抗性介导蛋白质的过表达产生的病原体抗性表型的那些方法。可将基因进行关闭使(外源)蛋白质不表达。在理想情况下，只将内源性基因进行了灭活。这对于消费者的认可及接受有值得考虑的优点，所述消费者经常对具本文档来自技高网...

【技术保护点】
在植物中用于产生或增强对至少一种病原体的抗性的方法，所述方法包括实施以下步骤：ａ）降低植物或其组织、器官、部分或细胞中ＮＡＤＰＨ氧化酶的蛋白质量、活性或功能，及ｂ）与起始植物相反或相比较，选择其中对至少一种病原体存在抗性或抗性增强的植物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：KH科格尔，R许克尔霍芬，M特鲁希略，
申请(专利权)人：巴斯福植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]