一种受植物系统获得性抗性诱导剂诱导的启动子及其应用技术方案

一种基因组ＤＮＡ分子序列，其特征在于，它调控ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ：２ｃＤＮＡ表达的基因５’上游ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．３或ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．４核苷酸序列，这些序列包含受ＰＢＺ诱导的调控元件和不同的组织特异性表达元件。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物分子生物学和基因工程
，具体涉及一种受植物系统获得性抗性诱导剂诱导的启动子及其应用。该启动子来源于拟南芥中对烯丙异噻唑(PBZ，Probenazole，3-烯丙氧基-2-苯丙异噻唑-1，1-二氧化物)及其相关活性产物诱导响应基因的上游非转录区域序列。这一启动子片段在单子叶和双子叶植物中能够借助于诱导物起始和驱动下游附近基因的表达。用这种启动子片段构建重组表达载体转化植物，可获得新型转基因植物。在这些新型转基因植物中，PBZ及其相关活性产物(BIT)可以随意地诱导目标基因的表达和调控。
技术介绍
在过去十多年中，人们已经获得了上百个在作物遗传改良中有重要应用价值的功能基因。随着功能基因组研究的进展，人们还会批量地克隆出有广泛应用价值的功能基因。这些多样性的基因资源将会被用来大规模地改良作物和其它重要植物，以便满足人口增长导致对粮食日益增长的需求，缓解环境治理和保护的巨大压力，以及为城镇居民提供丰富的生活必需品和高质量的生活环境。这些多样性的功能基因资源需要在不同类型启动子的调控下才能恰到好处地发挥作用。一般来说，启动子是位于基因编码区上游的一段DNA，包含转录起始区。启动子区域同时包含多种调控基因表达的元件，如大约位于转录起始位点上游30bp(-30)位置的TATA box，以及位于上游75bp位置的CAAT box。植物启动子中还包含可以感应其他外界因素的调控元件，诸如光、化学物质、营养条件、热、缺氧、重金属等环境因子，进而对相关基因进行表达调控。启动子内的另外一些DNA序列与发育的时序或基因表达的组织特异性有关。真核体系中还存在增强子序列，可以大大提高附近基因的表达水平；这些增强效应与其所处的位置和方向没有多大关系。近年来，植物基因工程技术在作物品种的遗传改良方面，特别是在抗病虫特性和抗除草剂特性，以及谷物籽粒品质改良上取得了令人瞩目的成就和进展，而且在许多其它方面也愈来愈显示出了其巨大的应用潜力，如植物生物反应器的构建等。然而，在取得这些突破性进展的同时，关于转基因植物的生态安全和食品安全问题也引起了公众越来越多的关注、争论甚至抗议。这中间除了非理性和非科学因素外，现行的选择性基因和目标功能基因的表达体系也的确存在其内在的局限性。自然状态下，生物体内基因的表达都受到严格的调控。调控因子可能是发育进程相关的，表现为基因的程序化表达，包括时空表达；也可能是环境因子诱导的，表现为基因的应急式表达。然而，目前植物基因工程中所用的启动子多为组成型的，这些组成型的启动子驱使选择性标记基因和目标功能基因持续高效表达，为转基因技术和转基因植物的安全性问题埋下了隐患。事实上，选择性标记基因只需要在筛选转化体时表达；抗病虫、抗除草剂及生物反应器中的目标功能基因也只是在生长发育特定的阶段需要表达，许多时候甚至仅仅是短暂的表达。对植物而言，外源基因的无效持续表达不仅是物质和能量不必要的消耗，而且还干扰植物细胞的正常生理活动，影响收获器官的产量和品质，甚至还会引起性状丧失等后果。最近在Bt(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白转基因棉花上已发现，体内毒性蛋白基因长时间的表达，易导致棉铃虫对毒性蛋白产生抗性(Mcaughey et al.，Nature biotechnol.16144-146.1998)。以植物作为生物反应器也存在类似的问题。对于生态环境而言，持续表达的外源基因可能会通过花粉或其它途径在近缘物种间转移，导致有潜在危害的部分选择性基因或功能基因及其控制的性状逃逸，进而对整个食物链和生物多样性造成难以预料的后果。为了克服组成型启动子在植物基因工程中的这些缺点，人们已经考虑开发利用诱导型启动子，组织特异性/发育阶段特异性启动子。诱导型启动子应用于植物基因工程有许多突出的优势，主要体现在1、目标功能基因可以根据需要诱导表达；2、基因的表达水平可以通过调节诱导剂/因子的强度而得到调节；3、通过使用不同的诱导剂/因子组合可以调节相关功能基因的协同表达。在植物上，创伤诱导表达系统是较早被研究的、试图用于抗病虫基因工程的一种诱导型表达系统(Lorberth et al.，Plant J. 2477-86.1992)。但是由于这类启动子是借助于病虫侵害引起的创伤来诱导目标功能基因表达，所诱导的抗病虫基因表达的速度和强度不足以产生及时有效的抗性，因而不能产生理想的抗性效果。此外，其它机械损伤，如暴风雨等，也能引起抗病虫基因不必要的表达。其次，缺氧诱导的玉米乙醇脱氢酶Adh I基因的启动子可能是研究得最为详尽的诱导型启动子之一。通过电穿孔的方法，将缺氧诱导的玉米乙醇脱氢酶Adh I基因转化源于悬浮培养的玉米原生质体(Howard，et al.，Planta，170535-450.1987)。转化后的原生质体置于低氧含量处，并于20小时后分析Adh I的表达。为便于测量缺氧诱导的Adh I表达，将天然Adh I基因5’调控片段(1096 bp)与CAT相连。他们的结果显示，在源于同源的培养细胞的原生质体中，标准的缺氧条件可以调控单子叶植物玉米的Adh I启动子/CAT基因。同时，他们又发现，在玉米原生质体中，Adh I的启动子片段本身就足以响应缺氧条件的诱导，进而调控外源基因的表达，无需编码区和3’区的存在。其他研究者(Lee et al.，Plant Physiology 85327-330 1987)进一步确定了玉米Adh I基因与缺氧诱导相关的DNA片段。这些研究者在玉米原生质体中转入包含CAT编码顺序和Adh I启动子的重组基因，24小时后检测CAT活性。通过改变启动子片段的长度，Lee等人确定从转录起始位点上游146bp的启动子顺序足以在缺氧状态下启动CAT的表达。然而启动子顺序向5’端继续延伸到266或955bp后，CAT表达量上升了5或8倍。Walker等人继续用瞬间表达方法研究玉米Adh I基因上游受缺氧诱导启动基因表达的顺序(Walker et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 846624-6628 1987)。他们确定了启动子中与缺氧诱导的基因表达相关的2段顺序-133--124和-113--99(转录起始位点上游)。这2段顺序对于诱导是必须的。在无亲缘关系的病毒启动子前添加这段40bp的元件后可以受缺氧诱导。另外有人发现在稳定转化的烟草细胞内，如果用玉米Adh I基因-1094-+106这一段调控CAT基因，在合适的缺氧条件下，有非常低的CAT基因表达(Ellis et al.，EMBOJournal 611-16 1987)。事实上，只检测到CAT的mRNA。然而，将octopine合成酶基因或花椰菜镶嵌病毒(CaMV)的启动子元件接在Adh I启动子的5’端，可刺激CAT的表达，并在缺氧诱导后检测到CAT。包含与Adh I基因转录起始位点5’相邻顺序247bp的片段，足以将CAT基因的表达置于缺氧调控之下。因此，即使在有组成型的octopine合成酶或CaMV 35S启动子片段存在的条件下，这段247 bp的顺序的存在仍使基因的表达受缺氧调控。Howard、Lee以及Walker等人通过瞬间表达分析获得的受缺氧诱导调控的Ad本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蒯本科，赵慧芳，顾华，王喜萍，赵向辉，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：