本发明专利技术涉及两个相思树纤维素合酶基因及以转基因技术利用它们来提高植物纤维素含量，并研究其可能功能的方法。木材作为一种重要的造纸原料，对其存在着速生性与高纤维品质的要求。但传统的改良措施的改造功效十分有限，以基因工程的手段去提高其品质，加快其生长速度不失为一种切实可行的方法。本发明专利技术从相思树中克隆了两个纤维素合酶基因，并构建了正义及反义的植物双元表达载体。其主要的目的就是加快一些热带、亚热带树种的生长速度，缩短其生育周期，增加其纤维素含量，同时改良多种植物的纤维素品质。其次，探讨这两个基因在相思树中的表达机制与机能。目前，在烟草中这两个基因已表现出提高转化受体植物纤维素含量的特性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及两个相思树纤维素合酶基因及以转基因技术利用它们来提高植物纤维素含量，研究其可能功能的方法。
技术介绍
相思树种共有1200余种，原产地为澳大利亚和非洲。它是一种适应性较强的树种，速生，能迅速固氮，改良土壤。其生长量、制浆性能和纤维质量都可以和桉树媲美甚至优于桉树，是一种优良的纸浆工业原料。我国引种的主要相思树种有大叶相思(Acacia auriculiformis willd)，马占相思(Acacia mangium willd)和厚荚相思(Acacia crassicarpa)。目前，主要分布于海南、福建及两广地区。在几种相思树种中，马占相思的制浆性能及纤维质量都优于其它两类相思树种，且由于其生长期相对较短(6年)，对土壤具有改良作用，成为东南亚一种普遍种植的造纸用树。纤维素是细胞壁的主要组成成分之一，也是评价造纸原料性能优劣的一个重要指标。纤维素的基本结构单位是吡喃式D-葡萄糖，以β-1，4糖苷键相连。植物细胞壁中多糖的结构、糖基组成、糖基间的连接键及糖基的修饰作用等已研究的较为清楚，但对涉及多糖合成的酶与多糖聚合还知之甚少。相思树作为一种重要的造纸原料，目前还没有有关其纤维素合酶方面的报道。纤维素合酶属于糖基转移酶类家族，后者基于其氨基酸序列的相似性被划分为47个家族。植物因其具有广泛的糖基转移反应，从而有大量的糖基转移酶类基因被分离、鉴定。第一个纤维素合酶基因是在本醋杆菌(Acetobacter xylinum)中分离得到的，它含有糖基转移酶类的D，D，D，QXXRW保守区域。植物中的纤维素合酶基因首先发现于棉花。由Pear等(1996)对棉花纤维cDNA文库进行随机时发现，其编码的蛋白具D，D，D，QxxRW保守特征。而在N-末端与保守的天冬氨酸残基之间还具额外的特异性片断，显示了独特的序列特征。目前，在拟南芥、玉米、杨树、水稻中已得到了编码纤维素合酶的基因全长。植物的纤维素合酶在N端特有一个类似于植物转录因子的“亮氨酸拉链”区域，称作LIM-like Zn-binding domain/RING finger区域，前者介导蛋白与蛋白间的相互作用，而后者在蛋白的泛数降解中具有功能，因此推测这个结构在CesA的功能实现中参与蛋白偶联和定向降解。与细菌的纤维素合酶不同，植物的CesA具有一个特异的植物特异性保守区CR-P(for conservedplant-specific)和植物特异的高度可变区HVR(for hyper-variable plant-specific)。但其功能目前还不清楚。目前，CesA的功能推测主要来自于基因表达、UDP-G结合实验、突变分析及基因沉默实验。Burton等(2000)借助病毒诱导的基因沉默技术对植物纤维素合酶基因进行了研究。他们采用马铃薯X病毒为载体，将一个推测可能编码纤维素合酶的基因导入烟草，结果烟草出现了矮化现象，纤维素含量明显降低，从而验证了目标基因编码的蛋白具纤维素合酶功能。但这种降低可被同源的乳糖的增加所抵消，从而说明在纤维素和果胶的生物合成过程中或其他可能的新陈代谢途径中存在着反馈环。此外，还可以根据突变分析、基因表达实验以及同源序列比较来分析不同的Ces的功能。目前已有研究证明，初生、次生细胞壁形成过程中，纤维素的合成涉及不同的纤维素合酶。Holland等(2000)对棉花、杨树、拟南芥及玉米的纤维素合酶进行了比较研究，结果表明这些酶本身的某些特异性序列决定其在初生或次生细胞壁中表达，而并非单独由启动子决定。初生与次生细胞壁中的纤维素具有不同的特征，比如聚合度，其特征差异可能与不同的纤维素合酶有关。Wu等(2000)从杨树中克隆了一个纤维素合酶基因PtCesA，正常生长时，其在木质部表达，在受到外界压力胁迫时，它在韧皮部微管中也有表达，说明它可能参与信号传导机制。
技术实现思路
迄今为止，我们对Ces的所知还相当有限。纤维素合酶超家族的基因分离和酶的结构及功能分析将有利于了解它们自然存在的结构及形态。而且，木材作为一种重要的造纸原料，对其也存在着速生性与高纤维品质的要求。但传统的改良措施对于生长周期相对较长的林木类植物的改造功效十分有限，以基因工程的手段去提高其品质，加快其生长速度不失为一种切实可行的方法。本专利技术的一个主要目的是加快一些热带、亚热带树种的生长速度，缩短其生育周期，增加其纤维素含量，提高可利用性。另外，多种植物的纤维素品质是重要的经济性状，纤维素合酶研究的深入最终会应用到经济植物目标改善的改良中。纤维素合酶的基因工程改造将提高纤维的品质，树种中纤维素的长度、长宽比、均匀度等。本专利技术现已1、从相思树中克隆得到了两个新的纤维素合酶基因AmCesA1，AmCesA2；2、构建了所克隆得到的两个相思树纤维素合酶基因的正义表达载体，用于转化烟草及桉树、杨树、矮牵牛等。期望由于外源CesA基因的引进，而增加其表达量，从而刺激植物生长，加快其生长速度。3、构建了所克隆得到的两个相思树纤维素合酶基因的反义表达载体，利用反义基因技术，即通过引入一个特定内源基因的反义序列来抑制其表达，从而研究两个纤维素合酶基因的功能。具体的技术方案如下1.从相思中获得纤维素合酶基因由于相思树中的纤维素合酶基因为未知序列，因此，我们比较了一系列已知的纤维素合酶的氨基酸序列，设计了两条简并引物，利用RT-PCR技术，再结合5`RACE技术，以获得全长的相思树纤维素合酶基因。简并引物序列保守区域I V I C EI(V) WF ACesDe15`＞g GTI AT(A/C/T)TG(T/C)GA(A/G)(A/G)TI TGG TT(T/C)GC＜3`保守区域II FP Q R F D G I DCesDe25`＞TT(T/C)CCI CA(A/G)(A/C)GI TT(T/C)GA(T/C)GGI AT(A/C/T)GA＜3`2.构建正义及反义形式的纤维素合酶基因植物表达载体我们选用了适用于大多数植物且启动能力很强的、亦是在植物基因工程中最常用的花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，将得到的两个正义及反义纤维素合酶基因连于其后，构建成功双元表达载体，转化植物。具体结构示意详见附图1。3.以烟草及桉树，杨树、矮牵牛等进行植物转基因操作烟草作为一种模式植物常常被用于转化外源基因以研究其功能。本专利技术以烟草为转化受体，导入纤维素合酶的正义及反义基因，以观察其对植物生长速率及生长状态的影响，进一步探讨其可能的功能。另外，也在杨树、桉树及矮牵牛上进行了转化研究。有益效果1.得到两个新的来源于相思树的纤维素合酶基因(AmCesA1、AmCesA2)。2.利用纤维素合酶基因的正义形式转化烟草，两个基因的功能已在烟草上得到了验证，推测它们对桉树及杨树等材料的转化，将会对加快其生长周期，提高其生长速度大有裨益。3.得到内源纤维素合酶基因沉默的转基因植株，观察这两个纤维素合酶基因对植物生长发育的影响，确定其在相思树中的功能。附图说明图1.植物表达载体示意2.转正义及反义AmCesA1基因烟草和对照比较示意3.转正义及反义AmCesA2基因烟草和对照比较示意图实施方式实验所涉及的药品均购自Promega公司，Takara公司，上海生工及欣经科公本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纤维素合酶基因，其特征在于具有序列１，ｃＤＮＡ长度为３２４９ｂｐ，该基因来源于相思树植物组织。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林忠平，王勇，胡茑雷，朱广廉，张爱琴，
申请(专利权)人：林忠平，王勇，胡茑雷，朱广廉，张爱琴，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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