在均相体系中大规模培养T-淋巴细胞的方法技术

一种用于ＴＡＬＬ淋巴细胞扩增的扩增方法，其中在均相培养体系中培养至少１×１０↑［９］个细胞。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利
涉及体外细胞培养和分离的人细胞的大规模扩增。现有技术一种抗肿瘤治疗方法，是以利用来自体内分离的细胞系或被赋予细胞毒活性的细胞为基础的。90年代初，从患有称作TALL的急性T细胞淋巴母细胞白血病的儿童体内，分离出多种T-淋巴细胞系。正如O’Connor等人(Blood，1991，771534-1545)和Cesano and Santoli(In Vitro Cell.Dev.Biol.，1992，28648-656)所描述的，它们包括T细胞系TALL-104、TALL-107、TALL-103/2。它们呈现出如此引人注意的特征，使其现已成功用于动物模型和人的肿瘤治疗(Cesano等人，Blood 1991，87393-403；Cesano等人，Cancer Res.，1996，563021-3029、US5,272,082；US5,683,690；US5,702,702)。TALL细胞系被赋予特异的抗肿瘤细胞毒活性，并且有效对抗不同类型的肿瘤这些细胞的主要特征在于它们是MHC非限制性的(Cesano等人，J.Immunol.，1993，1512943-2957)因而可对任何患者给药，不受组织相容性抗原表型的限制。而且，不同于某些类型的细胞毒淋巴细胞，例如TIL和LAK，体内给药后TALL细胞系不需要淋巴因子的伴随治疗。这是该细胞的另一优点，因为淋巴因子的同时给药具有若干缺点。另外，TALL淋巴细胞已在多种肿瘤中试验成功。这正是它们为什么被认为是一种值得关注的治疗选择的原因。但是，正如Cesano等人Cancer Res.，1996 564444-4452和Visonneau等人，Clin.CancerRes.，1997，31789-1797所描述，迄今所用的细胞扩增体系受到限制的，因为为过继性免疫疗法制备的细胞来自生长于单个摇瓶的培养物，尽管用于制备单克隆抗体和重组体蛋白质那样的大规模细胞培养装置已长期使用。因此，非常希望有适合这种细胞的大规模培养体系。专利技术概述本专利技术的一个目的在于提供一种方法，该方法以使用均相培养体系为基础，用于TALL淋巴细胞的大规模扩增和培养。“大规模数量的TALL淋巴细胞”代表至少1×109个细胞。具体而言，本专利技术方法使用的发酵罐或均相体系为细胞工厂，优选由数十个小室组成。可用本专利技术方法扩增的淋巴细胞选自由TALL-104、TALL-107、TALL-103/2组成的组，可任选经过遗传修饰。根据另一个实施方案，本专利技术涉及一种细胞采样方法，该方法对袋子装填夹头进行密封，从而生成至少一个采样小室，其中含有足够采样数目的细胞。附图简要说明附图说明图1为生长于摇瓶中的TALL细胞的葡萄糖水平和细胞浓度说明图。用15个摇瓶的TALL测定了以下参数细胞数/毫升(-◆-)和葡萄糖水平(深色线条)。专利技术详细说明本专利技术涉及TALL淋巴细胞的大规模扩增方法，其中在优选由单个发酵装置组成的均相体系中培养至少1×109个细胞。TALL(急性T细胞淋巴母细胞性白血病)淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞，来自类淋巴母细胞白血病儿科患者，包括TALL-104、TALL-107、TALL-103/2细胞系，正如O’Connor等人在Blood，1991，771534-1545和Cesano和Santoli在In Vitro Cell.Dev.Biol.，1992，28648-656所描述。优选的细胞系为TALL-104。TALL细胞还可以是经过遗传修饰的。目前它们在单个摇瓶中扩增所能达到的最大值仅为约1×108个细胞/T175摇瓶。因此，迄今制备含有治疗有效量的细胞袋，其包含细胞数为105～1012，优选1×107～1×1010，更优选1×108～2.5×109，涉及大量单个摇瓶的同时扩增。根据本专利技术定义，由于每个摇瓶的培养微环境不同，所以单个摇瓶中的培养代表不均一培养体系。因此，根据FDA指南美国卫生部的“工业指南用于人体细胞治疗和基因治疗指南”(CBER，March 1998，PointIII)—建议对由独立体系制备的每批细胞混合物应分别控制—所以用现有技术方法制备的来源于单个摇瓶的细胞代表不同的批次，因而应独立控制。因此，开发治疗用细胞，特别是TALL细胞的均相培养体系，对批次控制同样具有巨大的优势。此外，在大量单个摇瓶组成的多相体系中扩增，由于操作者重复进行手工操作，可能导致较高的污染风险。TALL细胞通常悬浮生长，但令人惊奇的是，在已知用于这种细胞的工业放大体系中，例如旋转摇瓶或miniPERM，其不能被放大或扩增。由于最大的商品化摇瓶(T175)最多只能容许获得1.5～2×108的TALL细胞，当生产细胞数目超过109，例如生产至少2.5×109治疗剂量的细胞时，细胞的分步-扩增变得极为复杂。申请人意外地发现，在均相体系中，例如通常用于贴壁依赖性细胞的细胞工厂中，可有效培养和扩增该细胞。相反地，传统用于大规模培养悬浮细胞，如具有与TALL细胞相似生长特性的杂交瘤细胞的旋转摇瓶或其它发酵罐却不适合。“大规模生产”是指在均相体系中生产至少1×109个TALL细胞。在本专利技术方法中，涉及细胞数目的数据存在约5％的容许误差，代表在Burker’s槽内测定细胞计数时的可能误差。例如，1×106个细胞事实上指的是0.95×106～1.05×106的细胞数目。测量误差是可变的，取决于采用的测量方法。根据本专利技术方法，在细胞工厂中的TALL扩增优选先进行预扩增，由在同一摇瓶中的一系列体积扩增组成(其中摇瓶用作细胞培养容器)，通过向培养物中连续加入新鲜的完全培养基，将全部培养物转入具有更大体积的摇瓶中，最终转至具有最大体积和最大表面积的商品化摇瓶，例如T175摇瓶中。根据本专利技术的优选特征，进行预扩增直至获得总数约3～4×108细胞，其中约2～2.5×108细胞用于各细胞工厂的接种，约1～1.5×108细胞用于在T175培养瓶中的并行维持。将细胞培养物分开，使细胞浓度值恢复至最佳接种值，即0.7～1×108细胞/毫升，在此称为″传代″。在此浓度下，细胞将迅速达到约2.5×109细胞/毫升的浓度。预扩增优选在完全培养基中进行，更优选IMDM，其含有2mM谷氨酰胺、浓度为2～20％，优选5％的胎牛血清(FBS)和细胞因子，优选白细胞介素，更优选IL-2或IL-15。优选，每隔48～72小时加入100IU/ml的IL-2。在均相体系中，扩增阶段用的培养基与预扩增阶段相同，但至少部分地将胎牛血清替换成人AB血清。该替换也可在细胞转入均相细胞培养体系之前，例如在预扩增阶段的最后一代进行。可用其它的培养基替代IMDM，例如RPMI、Ham’s-F12等等。优选无抗生素培养基。优选含2mM谷氨酰胺无抗生素的IMDM培养基，此处称为“完全培养基”；可向其中补充FBS或人血清。白细胞介素，优选IL-2或IL-15，每隔48～72小时加入细胞培养基中，至终浓度为50～150 IU/ml，更优选100 IU/ml。细胞优选在包含5～12％CO2，优选10％CO2的空气混合物中，于37℃孵育。所有传代出现的细胞或培养基的手工操作均在无菌条件进行，例如Biohazard垂直层流罩超静台(class 100)。根据特别优本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：西尔维娅·特拉夏蒂，玛丽亚·路易莎·诺利，路易吉·卡韦纳吉，纳迪娅·德贝纳尔迪，
申请(专利权)人：埃比奥吉恩药物股份公司，
类型：发明
国别省市：