一种用于培养人淋巴细胞的培养试剂制造技术

本发明专利技术公开了一种用于培养人淋巴细胞的培养试剂，包括基础培养基，还包括血清替代物和扩增促进剂；所述血清替代物包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白和重组人胰岛素，还包括脂质、微量元素化合物和维生素；所述脂质包括胆固醇、亚油酸、亚麻酸，所述微量元素化合物包括硝酸铁、亚硒酸钠、硫酸铜和硫酸锌；所述扩增促进剂为化合物Schinlignan F。本发明专利技术提供的培养试剂可以显著提高淋巴细胞的增殖倍数，促进淋巴细胞增殖，效果与阳性对照组基本一致，优于不添加扩增促进剂的培养试剂；本发明专利技术提供的培养试剂可以显著提高淋巴细胞的杀瘤活力，效果优于不添加扩增促进剂的培养试剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种用于培养人淋巴细胞的培养试剂。
技术介绍
有效的细胞免疫治疗离不开在体外大量培养、扩增和活化淋巴细胞。这其中使用量最大的试剂就是培养基。培养基为淋巴细胞的生长提供了基本的环境，包括为淋巴细胞存活提供适宜的渗透压，PH值，为淋巴细胞的生长提供了一切所需的营养因子，包括无机盐、氨基酸、功能性的蛋白、维生素等，也是淋巴细胞各种代谢产物的排放场所。传统的培养基为了提供这些营养因子，大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，比较常见的有新生牛血清、胎牛血清、人AB血清、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人转铁蛋白等。使用动物血清的优点是有足够的量供应，价格便宜，但是使用动物血清的缺点是有潜在传播传染病的风险，以及由于异种蛋白导致过敏症的发生，而且动物血清并不能很好的支持人淋巴细胞的生长。而使用人AB血清的好处是可以很好的支持人淋巴细胞的生长，但是人AB血清来源困难，供应量有限，而且也存在传播传染病的风险。现有商品化无血清淋巴细胞培养基大都添加有人血白蛋白、人转铁蛋白等人源性组分。由于这些组分来源于人的血清，虽然有各种病原体的检测技术和消毒技术，但仍然避免不了传播疾病的风险；由于来源于不同的供者，造成批次间差异，不利于质量的控制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能高效扩增人淋巴细胞的培养试剂，该培养基不采用动物或人的血清及其组分作为添加物，降低了传播疾病的风险，同时可以保证不同批次质量的均一性。本专利技术的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：用于培养人淋巴细胞的培养试剂，包括基础培养基，还包括血清替代物和扩增促进剂；所述血清替代物包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白和重组人胰岛素，还包括脂质、微量元素化合物和维生素；所述脂质包括胆固醇、亚油酸、亚麻酸，所述微量元素化合物包括硝酸铁、亚硒酸钠、硫酸铜和硫酸锌；所述扩增促进剂为化合物SchinlignanF。进一步地，所述重组人血白蛋白的浓度为5mg/L～20mg/L。进一步地，所述重组人转铁蛋白的浓度为40mg/L～80mg/L。进一步地，所述重组人胰岛素的浓度为10mg/L～40mg/L。进一步地，所述胆固醇浓度为0.5mg/L～2.5mg/L，亚油酸浓度为0.2mg/L～0.4mg/L，亚麻酸浓度为0.3mg/L～0.5mg/L。进一步地，微量元素化合物中的硝酸铁浓度为0.2mg/L～0.4mg/L，亚硒酸钠浓度为0.1mg/L～0.2mg/L，硫酸铜浓度为0.1mg/L～0.2mg/L，硫酸锌浓度为0.3mg/L～0.7mg/L。进一步地，所述维生素包括维生素E，维生素E浓度为4mg/L～8mg/L。进一步地，化合物SchinlignanF的浓度为5mg/L～15mg/L。进一步地，所述基础培养基为RPMI1640培养基。进一步地，所述基础培养基中添加1～3％体积百分含量的自体血清。本专利技术的优点：本专利技术提供的培养试剂能高效扩增人淋巴细胞，且杀瘤活性强。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本专利技术的实质性内容，但并不以此限定本专利技术保护范围。尽管参照较佳实施例对本专利技术作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的实质和范围。本专利技术化合物SchinlignanF的制备方法参见文献：Isolationandanti-hepatitisBvirusactivityofdibenzocyclooctadienelignansfromthefruitsofSchisandrachinensis,Phytochemistry,116(2015),253-261。实施例1：培养试剂组成每1LRPMI1640培养基中加入重组人血白蛋白10mg，重组人转铁蛋白60mg，重组人胰岛素25mg，胆固醇1.5mg，亚油酸0.3mg，亚麻酸0.4mg，硝酸铁0.3mg，亚硒酸钠0.15mg，硫酸铜0.15mg，硫酸锌0.5mg，维生素E6mg，化合物SchinlignanF10mg，庆大霉素10IU，搅拌使充分溶解，调节pH值为6.8～7.2之间，0.1μm滤膜过滤除菌，分装。实施例2：实施例1的对比，不添加扩增促进剂SchinlignanF每1LRPMI1640培养基中加入重组人血白蛋白10mg，重组人转铁蛋白60mg，重组人胰岛素25mg，胆固醇1.5mg，亚油酸0.3mg，亚麻酸0.4mg，硝酸铁0.3mg，亚硒酸钠0.15mg，硫酸铜0.15mg，硫酸锌0.5mg，维生素E6mg，庆大霉素10IU，搅拌使充分溶解，调节pH值为6.8～7.2之间，0.1μm滤膜过滤除菌，分装。实施例3：淋巴细胞增殖实验，测定存活率使用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞，或者复苏冻存的单个核细胞。加入含5％热灭活胎牛血清(FBS)生理盐水300g离心10分钟，去除上清。计数细胞，用相应的培养基配成1×106/ml细胞悬液。分为以下几组：阴性对照组：RPMI1640+10％FBS；实施例1组：实施例1制备的培养基；实施例2组：实施例2制备的培养基；阳性对照组：实施例1组唯一不同在于使用人源性白蛋白和转铁蛋白分别替代重组人白蛋白和重组人转铁蛋白。按每孔加入2ml培养基接入6孔板，每组3个复孔。第1天加入1000IU/mlIFN-r，培养24小时后加入50ng/mlCD3单抗(OKT3)、300IU/mlIL-2和100IU/mlIL-1a。以后每3天计数，补加含300IU/mlIL-2培养液至1×106/ml。培养15天，台酚蓝染色计算细胞增殖倍数和存活率，结果见下表。组别细胞增殖倍数存活率(％)阴性对照组2694实施例1组3896实施例2组2893阳性对照组3794上述结果表明，本专利技术提供的培养试剂可以显著提高淋巴细胞的增殖倍数，促进淋巴细胞增殖，效果与阳性对照组基本一致，优于不添加扩增促进剂的培养试剂。实施例4：杀瘤活力测定分组同实施例3。取培养15天的CIK细胞为效应细胞，以K562细胞为靶细胞，按效靶比10:1接种到96孔板内，37度5％CO2培养24小时。用MTT法测吸光度值，计算杀瘤率。杀瘤率％＝1-(试验孔-效应细胞孔)/靶细胞孔结果见下表。组别杀瘤率(％)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于培养人淋巴细胞的培养试剂，包括基础培养基，其特征在于：还包括血清替代物和扩增促进剂；所述血清替代物包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白和重组人胰岛素，还包括脂质、微量元素化合物和维生素；所述脂质包括胆固醇、亚油酸、亚麻酸，所述微量元素化合物包括硝酸铁、亚硒酸钠、硫酸铜和硫酸锌；所述扩增促进剂为化合物Schinlignan F。

【技术特征摘要】
1.一种用于培养人淋巴细胞的培养试剂，包括基础培养基，其特征在于：还包括血清替
代物和扩增促进剂；
所述血清替代物包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白和重组人胰岛素，还包括脂质、
微量元素化合物和维生素；所述脂质包括胆固醇、亚油酸、亚麻酸，所述微量元素化合物包
括硝酸铁、亚硒酸钠、硫酸铜和硫酸锌；
所述扩增促进剂为化合物SchinlignanF。
2.根据权利要求1所述的用于培养人淋巴细胞的培养试剂，其特征在于：所述重组人血
白蛋白的浓度为5mg/L～20mg/L。
3.根据权利要求1所述的用于培养人淋巴细胞的培养试剂，其特征在于：所述重组人转
铁蛋白的浓度为40mg/L～80mg/L。
4.根据权利要求1所述的用于培养人淋巴细胞的培养试剂，其特征在于：所述重组人胰
岛素的浓度为10mg/L～40mg/L。
5.根据权利要求1所述的培养试剂，其特征在于：所述胆固醇浓度为0.5mg/L～2.5mg/L，
亚油酸浓度为0.2mg/L～0...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵玲玲，
申请(专利权)人：赵玲玲，
类型：发明
国别省市：江苏;32