接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶及其制备方法和应用。该可注射水凝胶主要由聚合后具有温敏性的单体、含有羧基基团的单体、RGD短肽先后通过共聚反应、脱水酯化反应、无铜点击化学制备短肽功能化聚合物，经过与细胞共混，制得含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶。利用可注射水凝胶的温敏特性，达到溶胶‑凝胶的相转变，以及短肽的生物活性及其配体识别位点特征，促进细胞在可注射水凝胶支架内部的黏附、增殖和基因的特异性表达。本发明专利技术的可注射水凝胶具有优异的促细胞黏附、增殖特性、可控的温敏性、可逆的可注射性、细胞可释放功能。可用于可注射细胞支架、药物控释、组织再生修复、肿瘤治疗等领域。

Grafted RGD short peptide thermosensitive hydrogels and their preparation methods and Applications

The invention relates to the grafted RGD short peptide thermosensitive hydrogel and the preparation method and application. The injectable hydrogel is mainly composed of polymerization temperature sensitive monomer, monomer containing carboxyl groups, RGD peptide successively through copolymerization reaction, esterification reaction, copper free click chemistry preparation of short peptide functionalized polymers and blends prepared by cells, containing the cell graft RGD peptide can be temperature sensitive hydrogel injection. The temperature sensitive characteristic of injectable hydrogel, sol gel phase transition to, and short peptide biological activity and ligand recognition site characteristics, promote the expression of cell specific in internal injection hydrogel scaffolds adhesion, proliferation and gene. The injectable hydrogels of the invention have excellent cell adhesion, proliferation, controllable temperature sensitivity, reversible injectable and cell release functions. It can be used in the fields of injectable cell scaffold, drug controlled release, tissue regeneration and repair, tumor treatment and so on.

【技术实现步骤摘要】
接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶及其制备方法和应用
本专利技术属于高分子化学、生物医用材料和组织工程
，具体涉及接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶及其制备方法和应用。
技术介绍
可注射水凝胶是指在注射前为流动液态，注射到体内，可原位凝胶化的水凝胶。作为一种新型的生物医用材料，可注射水凝胶具有许多其他生物材料无法比拟的优点：1)可通过非侵入方式移植到体内，避免高创性外科手术；2)活细胞、蛋白质、药物或者其他生物活性物质可通过与凝胶前体混合，实现均匀包裹；3)与预成型支架相比，与周围组织衔接紧密，可用于填充任何形状的缺损，修复形状复杂的组织，大大降低植入对机体组织的侵入性，且能与各种治疗药物混合。由此避免了外科手术的高度创伤性，简化治疗过程、减少病人痛苦、降低医疗费用。因此在生物活性分子控释、细胞包埋以及组织支架材料等方面有着广泛的应用前景。根据形成原理，可注射水凝胶可分为化学交联水凝胶和物理交联水凝胶两大类。化学交联水凝胶可分为交联剂交联、辐射交联、光引发交联等类型；物理交联水凝胶可分为温敏性水凝胶和分子自组装水凝胶等类型。由于温敏性可注射水凝胶在水中经过简单的相转变(溶胶-凝胶转变)形成水凝胶，不需要任何化学反应，因而在体内更简单、更安全、且具有可逆性。目前用于药物凝胶剂型及组织工程的温敏性可注射水凝胶主要有聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(PEG-PPG-PEG)、聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯(PCL-PEG-PCL)等类型的嵌段共聚物，这类嵌段共聚物分子链由于同时具有疏水性基团和亲水性基团，在温度变化时，亲疏水性主导作用发生转变，在较低温度(低临界相转变温度)以下呈溶胶状，在注射体内后随温度升高，发生溶胶-凝胶转变。中国专利CN102827446A公开了一种温度响应型可注射水凝胶及其制备方法和用途，该可注射水凝胶主要由胆固醇-聚乙二醇-胆固醇(CHOL-PEG-CHOL)三嵌段化合物与氨基化β-环糊精接枝醛化葡聚糖加水混合溶胀制备而成，特征在于具有一定的强度、韧性和自修复性，与传统技术相比改善了凝胶性能的可控性以及进一步提高了凝胶的生物相容性。中国专利CN105664245A公开了一种可注射型超分子水凝胶及其制备方法，主要由明胶、含有氨基和/或环氧键的硅烷偶联剂和β-环糊精通过主客体化学制备，该超分子水凝胶具有可调控的力学性能，可注射性以及促软骨再生修复能力，同时能够极好地粘附于组织而不易流失，具有很好的临床应用前景。但这两种可注射水凝胶仍然不具有仿细胞外基质特性，后者所用硅烷偶联剂也具有一定的细胞毒性，且制备过程也相对复杂。为此，寻求一种具有仿细胞外基质、生物相容性良好、温敏性可控且具有可逆特性的可注射水凝胶，一直是科研工作者们追求的热点。对于仿细胞外基质组织工程材料，Hubbell[J.A.Hubbell，Bioactivebiomaterials[J].CurrentOpinioninBiotechnology，1999，10(2)：123-129.]认为关键在于生产具有生物活性的材料，而传统的可注射水凝胶目前所见多是将具有生物活性物质直接加入可注射水凝胶中进行物理混合，或者是添加生物活性良好的天然物质，如壳聚糖、胶原蛋白、透明质酸等，而很少有将生物活性因子或者介导细胞与外环境直接作用的物质接枝到生物材料上，从而使材料大分子链上含细胞活性分子。对于这一类物质，早在1984年，Pierschbacher等[M.D.Pierschbacher，E.Ruoslahti，Cellattachmentactivityoffibronectincanbeduplicatedbysmallsyntheticfragmentsofthemolecule[J].Nature，1984，309(5963)：30-33.]首次报道在整合素(介导细胞与其外环境之间的跨膜受体称为整合素)结合配体的过程中，有这么一种特殊的RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，简称RGD序列)是其结合配体最常见的识别位点。因此，若能将含有RGD这一特殊序列的短肽接枝到材料上，则能够有效促进细胞在生物材料表面的黏附，提高生物材料的细胞相容性。Smith等[E.Smith，J.Yang，L.McGann，etal.RGD-graftedthermoreversiblepolymerstofacilitateattachmentofBMP-2responsiveC2C12cells[J].Biomaterials，2005，26(35)：7329-7338.]在热可逆生物材料N-异丙基丙烯酰胺与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺无规共聚物(简称P(NIPAM-co-NASI))表面，通过氨基与琥珀酰亚胺的置换反应接枝了含RGD短肽，研究发现小鼠成肌细胞(C2C12)对RGD接枝的P(NIPAM-co-NASI)表面的黏附显著高于未接枝RGD的P(NIPAM-co-NASI)表面，但是仅仅停留在材料的二维表面研究细胞的黏附作用，未深入到细胞生存的三维环境中。中国专利CN104307049A公开了一种仿细胞外基质可注射的原位水凝胶及其制备方法与应用，主要是由巯基化明胶、巯基化多糖、或含RGD的细胞粘附肽通过聚乙二醇双丙烯酸酯发生交联反应来制备，制备可注射水凝胶具有良好的生物相容性、调控细胞行为的作用，但因其明胶、多糖需要巯基化修饰导致制备工艺复杂，含天然高分子导致温敏可控性不好，且由于迈克尔(Michael)加成反应之后导致可注射性不可逆，而不能得到广泛应用。因此，若能提供一种简单无毒高效的合成方法，制备一种在大分子链上接枝细胞活性因子(RGD短肽)的高聚物，兼具优良的生物相容性、可控的温敏性能且可逆的可注射性，可有效促进水凝胶内细胞特异性黏附及基因的特异激活，以满足其在组织工程中的应用。
技术实现思路
基于上述技术问题，本专利技术提供一种接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶及其制备方法和应用。本专利技术的可注射水凝胶在大分子链上接枝了具有生物活性的识别位点，可有效促进细胞的黏附和增殖，及其特定基因的表达，聚合后的大分子具有可控的温敏性和可逆的可注射性，使得所制备的水凝胶随温度变化可发生溶胶-凝胶相转变，从而分离出所培养的细胞。此外，可通过非侵入性方式注射到体内，避免高创伤性外科手术。本材料制备方法简易，无生物毒性，生物相容性好，在组织工程领域有着广泛的应用前景。为实现本专利技术的目的，提供以下方案：接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶主要是由聚合后具有温敏性的单体M1、含有羧基基团的单体M2、引发剂M3与催化剂M4通过共聚反应制备含羧基官能团共聚物A；再由共聚物A、烯类单体M5、有机溶剂M6、有机合成脱水剂、亲核酰化催化剂与沉淀剂M7通过脱水酯化反应制备双键功能化聚合物B；最后由双键功能化聚合物B与生物短肽M8通过无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C；经过与细胞共混，制得含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶。所述的聚合后具有温敏性的单体M1为甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N-乙烯基己内酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺中的任意一种。所述含有羧基功能团的单体M2为丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、丁烯酸、甲基丁烯酸、戊烯酸、己烯酸、庚烯酸中的任本文档来自技高网...

【技术保护点】
接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶主要是由聚合后具有温敏性的单体M1、含有羧基基团的单体M2、引发剂M3与催化剂M4通过共聚反应制备含羧基官能团共聚物A；再由共聚物A、烯类单体M5、有机溶剂M6、有机合成脱水剂、亲核酰化催化剂与沉淀剂M7通过脱水酯化反应制备双键功能化聚合物B；最后由双键功能化聚合物B与生物短肽M8通过无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C；经过与细胞共混，制得含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶；所述的聚合后具有温敏性的单体M1为甲基丙烯酰胺、N‑异丙基丙烯酰胺、N‑正丙基丙烯酰胺、N，N‑二乙基丙烯酰胺、N‑乙烯基己内酰胺、N‑羟甲基丙烯酰胺中的任意一种；所述含有羧基功能团的单体M2为丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、丁烯酸、甲基丁烯酸、戊烯酸、己烯酸、庚烯酸中的任意一种或任意两种的混合物；所述的引发剂M3为过硫酸钾、过硫酸铵中的任意一种；所述的催化剂M4为四甲基乙二胺、亚硫酸钠中的任意一种；所述的烯类单体M5为丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯酸羟丁酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯中的任意一种或任意两种的混合物；所述的有机溶剂M6为二氯甲烷、四氢呋喃、N，N‑二甲基甲酰胺、N，N‑二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙酸丁酯中的任意一种；所述的有机合成脱水剂为二环己基碳二亚胺，所述的亲核酰化催化剂为4‑二甲氨基吡啶；所述的沉淀剂M7为乙醚、正己烷、石油醚、苯、乙酸乙酯、苯甲酸丁酯、四氯化碳、丙醚、正戊烷中的任意一种；所述的生物短肽M8为c(RGDfC)、RGDC、CRGDFGPDC、c(RGDyC)、GRGDSPC中的任意一种。...

【技术特征摘要】
1.接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶主要是由聚合后具有温敏性的单体M1、含有羧基基团的单体M2、引发剂M3与催化剂M4通过共聚反应制备含羧基官能团共聚物A；再由共聚物A、烯类单体M5、有机溶剂M6、有机合成脱水剂、亲核酰化催化剂与沉淀剂M7通过脱水酯化反应制备双键功能化聚合物B；最后由双键功能化聚合物B与生物短肽M8通过无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C；经过与细胞共混，制得含有细胞的接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶；所述的聚合后具有温敏性的单体M1为甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N-乙烯基己内酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺中的任意一种；所述含有羧基功能团的单体M2为丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、丁烯酸、甲基丁烯酸、戊烯酸、己烯酸、庚烯酸中的任意一种或任意两种的混合物；所述的引发剂M3为过硫酸钾、过硫酸铵中的任意一种；所述的催化剂M4为四甲基乙二胺、亚硫酸钠中的任意一种；所述的烯类单体M5为丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯酸羟丁酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯中的任意一种或任意两种的混合物；所述的有机溶剂M6为二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙酸丁酯中的任意一种；所述的有机合成脱水剂为二环己基碳二亚胺，所述的亲核酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶；所述的沉淀剂M7为乙醚、正己烷、石油醚、苯、乙酸乙酯、苯甲酸丁酯、四氯化碳、丙醚、正戊烷中的任意一种；所述的生物短肽M8为c(RGDfC)、RGDC、CRGDFGPDC、c(RGDyC)、GRGDSPC中的任意一种。2.接枝RGD短肽温敏可注射水凝胶的制备方法，包括下列步骤：1)含羧基官能团共聚物A的制备：25℃下将聚合后具有温敏性的单体M1、含有羧基基团的单体M2依次加入到去离子水中搅拌溶解，配成质量浓度为4-12wt％的溶液，置于4℃冰水浴中搅拌，通入氮气20-40min，每隔10-15min依次加入引发剂M3，催化剂M4，取出后密封，置于20-30℃水浴中反应12-24h，将M1与M2的共聚物置于透析袋中透析3-6d，每8-12h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥8-12h，得到共聚物A干燥粉末；2)双键功能化聚合物B的制备：将步骤1)制得的共聚物A搅拌溶解在有机溶剂M6中，浓度为0.5-2wt％，每隔5-8min依次加入烯类单体M5和亲核酰化催化剂4-二甲氨基吡啶，活化20-30min后，滴加有机合成脱水剂二环己基碳二亚胺，20-30℃反应12-24h，将聚合物溶液浓缩至8-12mL，加入到沉淀剂M7中进行沉淀，得到固体，并将其常温搅拌溶于去离子水中，置于透析袋中透析3-6d，每8-12h更换一次去离子水，取出后冷冻干燥8-12h，得到双键功能化聚合物B干燥粉末；3)无铜点击化学制备短肽功能化聚合物C：将步骤2)制得的共聚物B溶解于HEPES缓冲溶液中，共聚物B的浓度为0.5-3wt％，通入氮气20-40min，加...

【专利技术属性】
技术研发人员：张青松，杨超超，李晓朋，金学东，杨舒淋，李云飞，穆齐锋，陈云生，刘鹏飞，陈莉，
申请(专利权)人：天津工业大学，
类型：发明
国别省市：天津,12