本发明专利技术公开了一种新型ＲＧＤ葡激酶双功能分子，还公开了其制备方法及用途。本发明专利技术的双功能分子是将葡激酶或其衍生物的３５、３６、３７位氨基酸顺序替换为精氨酸Ｒ、甘氨酸Ｇ和天门冬氨酸Ｄ。制备该突变体的方法包括葡激酶基因定点突变、与表达载体连接、在大肠杆菌中高效表达、分离纯化等步骤。本发明专利技术的葡激酶突变体可以作为一种溶栓药物使用，具有溶栓和抗凝双重活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种葡激酶双功能分子，其制备方法及用途，具体的说，本专利技术涉及一种新型具有RGD序列的葡激酶双功能分子，其制备方法及其在制备抗凝、溶栓药物上的应用。
技术介绍
葡激酶(Staphylokinase，SAK)是一种由金黄色葡萄球菌中溶源性噬菌体分泌的蛋白质，其成熟蛋白质由136个氨基酸组成，相对分子量为15000。SAK是一种纤溶酶原(Plaminogen，P1g)的激活因子，在血浆中与P1g形成1∶1复合物，该复合物被血块表面痕量纤溶酶(Plasmin，Plm)激活为SAK-Plm，SAK-Plm是高效纤溶酶原激活剂，特异切割Plg形成有活性的Plm，溶解血栓，其溶解血栓特异性强。它作为新一代溶栓药物，溶栓效力与当前最理想的溶栓药t-PA及其衍生物相当。在一项多中心随机开放实验中，100个急性心肌梗死(AMI)病人用剂量相当的SAK和alteplase(t-PA的一种衍生物)比较治疗发现，给药90分钟后，用alteplase的病人组58％获得完全再通，而用SAK的病人组再通率达62％。说明SAK与alteplase治疗对早期冠状动脉再通至少同样有效。此外，葡激酶可以通过原核基因工程制备，价格却远远低于t-PA及其衍生物，便于其推广应用(王晓文，杨子义，新型葡激酶的研究进展，解放军药学学报，第19卷第3期)。目前葡激酶在我国已经获得新药证书上市，国外则正在进行II/III临床研究。尽管文献报道SAK对富含血小板的血栓溶解效果较其他溶栓药好，但使用SAK后仍然会有一定比例的再阻塞率，国外的两篇报道再阻塞率分别为13.8％和12％(杨胜荣，周丽娟，丛洪良等，国产重组葡激酶耐受性和安全性的临床试验，河北医药2001年第23卷第5期)，积极地抗凝、抗血小板治疗仍然是不可缺少的。因此，构建具有抗凝活性的葡激酶分子可以有效降低再阻塞率，进一步提高SAK的临床疗效。RGD肽序是血小板膜糖蛋白GP IIb/III a的结合基序，存在于纤维蛋白原(Fgn)、纤维粘联蛋白等分子中，Fgn与血小板GP IIb/III a结合是血小板聚集的前提，因此外源RGD肽序通过与Fgn竞争结合血小板表面的GP IIb/III a，可以抑制血小板聚集。而Fgn受体只在血小板活化后GP IIb与GPIII a才形成有功能的二聚体，这样外源RGD肽序只能与血栓部位活化的血小板结合，对循环血小板无影响，RGD肽序还具有特异性靶向作用，溶栓药物特异靶向性增加可以减少药物用量，减弱出血倾向。因而RGD葡激酶可望成为双功能新型溶栓和防栓药。Walda等将RGD融合序列连接在SAK的C末端，但溶栓活性大大削弱。国内复旦大学医学院将葡激酶的109、110和111为氨基酸顺序更换为RGD序列，构建的RGD-SAK基本保持了与野生型相仿的催化效率，但在大肠杆菌高效表达中以包涵体形式存在，需要进行变复性工作，而复性工作是获得活性蛋白质的难点和重点(程鏖，宋刚，苏华波等，生物工程学报，2002，18卷第6期)。因为野生型葡激酶在大肠杆菌中高效表达为可溶性功能表达，所以显然在该位置引入RGD序列不利于葡激酶分子的折叠。且未见到构建的RGD-SAK的抗凝活性测定结果。
技术实现思路
为克服上述RGD-SAK活性下降和不溶性表达的缺点，本专利技术提供了一种具有溶栓和抗凝双重活性的新型RGD葡激酶双功能分子。本专利技术还公开了该葡激酶突变体的制备方法。本专利技术还公开了该葡激酶突变体在制备溶栓药物中的应用。本专利技术的新型RGD葡激酶双功能分子，是将葡激酶或其衍生物的35、36，37位氨基酸顺序替换为精氨酸R、甘氨酸G和天门冬氨酸D。在该位置上引入RGD序列不仅保持了葡激酶的溶栓活性，而且表达产物为可溶性表达，同时具有较好的抗凝活性。从葡激酶的三维结构上看(Rabins A，Debondt H，Deranter C，et al，Threedimensional structure of staphylokinase，a plasmingen activator with therapeuticalpotential.Nat Struct Biol，1997，4357-360)，35、36，37位氨基酸位于分子结构的外部，远离已知的活性中心。而35位氨基酸由赖氨酸K变为精氨酸R、37位氨基酸由天门冬氨酰胺酸N变为天门冬氨酸D，本身氨基酸结构的改变就很小。计算机序列分析结果表明，有部分野生型SAK的序列36位氨基酸本身就是甘氨酸G，所以36位氨基酸改变为甘氨酸G应该不会影响活性。所以，在该位置上引入RGD序列一方面RGD会发挥较好的抗凝活性，另一方面对SAK的活性影响会较小。同时会利于构建分子的细胞内折叠，实现可溶性表达。不难理解为获得具有抗凝和溶栓活性双重功能的分子，葡激酶野生型和突变体，均可在上述位置引入RGD序列，如低免疫原性SAK突变体。本专利技术实施例即是在一种低毒性SAK的基础上引入RGD序列构建的双功能分子，获得的分子不仅保持了葡激酶的溶栓活性，而且表达产物为可溶性表达，同时具有较好的抗凝活性。本专利技术公开了一种具有序列表中序列1所示的氨基酸序列的RGD葡激酶双功能分子。本专利技术还公开了一种编码RGD葡激酶双功能分子的基因，该基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。本专利技术还公开了上述RGD-SAK双功能分子的制备方法。该方法包括如下步骤(1)制备葡激酶突变体编码基因；(2)突变基因与表达载体进行连接；(3)在大肠杆菌中进行高效表达；(4)葡激酶突变体的分离纯化。制备葡激酶突变体编码基因可以按照实验室常规方法进行，优选PCR法。优选PCR重叠引物延伸法(黄培堂等译，J.萨母布鲁克，D.W.拉塞尔著，分子克隆实验指南第三版，p1091-1113)。所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，如商业PET系列载体和国内广泛使用的PBV220载体，优选PBV220载体。大肠杆菌可以是适合原核系统表达的配套大肠杆菌，当使用PET类载体，宿主菌优选E.coli BL21(DE3)系列；当使用PBV220载体时宿主菌可选择多种商业上提供的大肠杆菌，优选E.coli DH5α。本专利技术构建的SAK突变体基因与pBV220相连接，在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达。表达产物主要以可溶性状态存在。经分离纯化，获得了电泳纯的SAK突变体。纯化蛋白用BCA方法进行蛋白定量(汪家政，范明。蛋白质技术手册。北京科学出版社，2000，51-54.)。本专利技术还公开了该RGD-SAK双功能分子在制备抗凝、溶栓药物中的应用，本专利技术的RGD-SAK双功能分子可能用于急性心肌梗塞、外周动脉血栓和深部静脉血栓等血栓性疾病的抢救和治疗。以相同方法制备的野生型SAK为对照，采用纤维蛋白溶圈法进行双功能分子的溶栓活性测定，通过血小板聚集试验进行抗凝活性测定，通过豚鼠试验进行其免疫原性测定。结果表明，该分子溶栓活性与野生型葡激酶相当，具有野生型葡激酶不具备的抗凝活性，且免疫原性较野生型显著更低。附图说明图1为葡激酶突变体PCR产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱1为DNA分子量标准2.重叠引物延伸获得的PCR产物图2为RGD-葡激酶表达蛋白的SDS-PAGE分析1为裂解物的沉淀；2为裂解物的上清；3为纯化的野生型葡激酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＲＧＤ葡激酶双功能分子，其特征在于将葡激酶或其衍生物的３５、３６、３７位氨基酸顺序替换为精氨酸Ｒ、甘氨酸Ｇ和天门冬氨酸Ｄ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜永强，郑玉玲，宁保安，马茹，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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