本发明专利技术属于基因工程领域，公开了ＮＹＧＧＦ５蛋白及其编码基因在制备抑制脂肪细胞分化药物中的应用。本发明专利技术针对ＮＹＧＧＦ５蛋白及其编码基因功能不明的技术问题，提出了ＮＹＧＧＦ５蛋白及其编码基因在制备抑制脂肪细胞分化药物中的应用的技术方案，从而可利用ＮＹＧＧＦ５蛋白及其编码基因制备抑制脂肪细胞分化的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及NYGGF5蛋白及其编码基因在制备抑制脂肪细胞分化药物中的应用。
技术介绍
随着经济的发展，无论是发达国家还是发展中国家，肥胖患病率都正以惊人的速度在不断上升。从全球范围来看，符合超重标准的成年人已超过十亿其中三亿属肥胖，WHO已将肥胖列入全球十大危险因素之一，如何预防及治疗肥胖受到人们的普遍关心。传统理论指导下控制饮食与增加运动的肥胖治疗模式常常收效甚微，因此在分子水平上开展肥胖病因研究以寻找有效防治策略开始受到关注，目前已发现300余条与肥胖有关的基因。脂肪组织有细胞和基质组成，而细胞成分包括了脂肪前体细胞、成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等，其中脂肪前体细胞过度增殖与分化被认为是肥胖发生的重要环节。从Swiss 3T3小鼠胚胎中分离克隆的3T3-L1细胞株在融合成单层的情况下具有自发分化为成熟脂肪细胞的能力，由于在体内可以分化并形成与正常脂肪组织无明显差别的脂肪团块，从而能够模拟活体脂肪组织的功能，因此已成为肥胖研究的一个常用体外研究工具。在先前研究中，我们应用cDNA微阵列(cDNA microarray)技术分析了肥胖大鼠脂肪组织基因表达谱，获得一条在肥胖大鼠脂肪组织中表达显著下调的新基因，命名为NYGGF5(GenBank登录号AY 512661)基因。该基因cDNA全长963bp(SEQ ID No.1)，开放阅读框长828bp(123bp-950bp)，编码276个氨基酸，我们将此276个氨基酸组成的蛋白命名为NYGGF5蛋白。目前没有NYGGF5蛋白及其编码基因具有何种功能的报导。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术问题，提供NYGGF5蛋白及其编码基因在制备抑制脂肪细胞分化药物中的应用。本专利技术的目的是通过下列技术措施实现的NYGGF5蛋自在制备抑制脂肪细胞分化药物中的应用。编码NYGGF5蛋白的基因在制备抑制脂肪细胞分化药物中的应用。本专利技术的有益效果本专利技术经过研究发现在脂肪前体细胞中稳定表达NYGGF5蛋白，与阴性对照相比，明显抑制脂肪细胞的分化，从而提出NYGGF5蛋白及其编码基因在制备抑制脂肪细胞分化药物中的应用的技术方案，根据本专利技术提出的技术方案可利用NYGGF5蛋白及其编码基因制备抑制脂肪细胞分化的药物。附图说明图1是脂肪前体细胞中稳定表达NYGGF5蛋白的验证。1为过表达NYGGF5蛋白的3T3-L1细胞；2为转染空载pcDNA3.1 myc/his a(-)的对照细胞。以β-actin作为阳性对照，转染空载pcDNA3.1 myc/his a(-)及转染NYGGF5基因开放阅读框片段的3T3-L1细胞均有β-actin蛋白表达，而仅有转染了NYGGF5基因开放阅读框片段的3T3-L1细胞有NYGGF5蛋白的表达。图2是脂肪细胞分化油红O染色图。图中A为转染空载pcDNA3.1 myc/his a(-)的3T3-L1细胞；B为过表达NYGGF5蛋白的3T3-L1细胞。1为分化第0天；2为分化第2天；3为分化第4天；4为分化第6天；5为分化第8天。图3是分化第八天脂肪细胞内甘油三酯含量比较图。其中标示空载为转染空载pcDNA3.1myc/his a(-)的3T3-L1细胞，标示NYGGF5为过表达NYGGF5蛋白的3T3-L1细胞。具体实施例方式以下通过实施例对本专利技术作进一步阐述，但不限制本专利技术。本专利技术中NYGGF5蛋白是指由NYGGF5基因cDNA的开放阅读框(64bp-930bp)编码的276个氨基酸的蛋白质。实施例11材料和方法1.1实验材料本试验所需的具有新霉素抗性的真核表达载体pCDNA3.1 myc/his a(-)购自美国invitrogen公司，pMD-18T载体、J18感受态大肠杆菌购自Takara公司；脂肪前体细胞3T3-L1购自美国ATCC细胞库；新霉素G418、3-异丁甲基黄嘌呤(MIX)、地塞米松、胰岛素及油红O购自美国sigma公司；蛋白鉴定所用抗体小鼠6×His抗体及羊抗小鼠Ig-G辣根过氧化物酶购自clontech公司；dNTP，磷酸缓冲液PBS等生化试剂均购自大连宝生物公司。1.2表达载体的构建采用Trizol提取大鼠网膜后脂肪组织RNA(具体步骤参考invitrogen产品操作手册)，经反转录成cDNA，利用NYGGF5特异性引物上游5’-ACCGTGGCCGAGCTAGATG-3’(SEQ ID No.2)，下游5’-GTCCATTCTAAGCCCCTAAA-3’(SEQ ID No.3)，扩增出包含NYGGF5蛋白编码序列的PCR产物，直接连接入pMD-18T载体。测序验证含有NYGGF5基因开放阅读框(123bp-950bp)片段后，以此载体(即含有NYGGF5基因开放阅读框片段的载体)为模板，PCR扩增两头带HindIII和EcoRI酶切位点产物。将扩增后产物与真核表达载体pCDNA3.1 myc/his a(-)采用上述两种酶进行酶切，纯化连接酶切后的pCDNA3.1载体和PCR产物，转化入J18感受态大肠杆菌中扩增。测序验证含有NYGGF5基因开放阅读框片段无误后抽提质粒，即得NYGGF5真核表达载体，备用。1.3NYGGF5蛋白稳定表达细胞的筛选与建立将构建好的NYGGF5真核表达载体转染脂肪前体细胞3T3-L1，转染了空载pCDNA3.1 myc/his a(-)的脂肪前体细胞作为对照细胞。转染24小时后，用新霉素G418(浓度为800μg/ml)进行筛选。筛选维持两周，含有NYGGF5蛋白表达的阳性细胞株存活，其余无表达的细胞死亡，G418降至200μg/ml维持，细胞繁殖扩增。将转染NYGGF5真核表达载体及转染空载pCDNA3.1myc/his a(-)的3T3-L1细胞分别抽提蛋白，验证NYGGF5蛋白的表达。结果见图1。1.4脂肪细胞刺激分化将NYGGF5蛋白稳定表达细胞及空载对照3T3-L1细胞接种于6孔细胞培养板，以含200μg/ml G418、10％胎牛血清的DMEM高糖培养基(即完全培养基)进行培养。待细胞达100％融合后两天(计为0天)起予MDI方案进行刺激以诱导分化，即第0天加入0.5mmol/l MIX、0.25μmol/l地塞米松及100nmol/l胰岛素，48小时后(48小时是指第0天和第1天，为刺激分化过程中公认的计算方法)撤去MIX和地塞米松，改为单剂100nmol/l胰岛素继续刺激48小时，第4天起以完全培养基维持生长，每两天更换培养基一次，至第8天95％空载对照细胞分化为成熟脂肪细胞时，结束分化过程。1.5脂肪细胞分化的鉴定 A.刺激分化过程中的第0、2、4、6、8天，将两组细胞分别以0.01mol/l PBS洗涤两遍后以4％多聚甲醛予室温下固定30分钟，再以PBS洗涤两遍，以0.6％(w/v)油红O室温下染色60分钟，双蒸水冲洗干净后倒置显微镜下进行观察、拍照。结果见图2。B.刺激分化末，对两组细胞进行细胞计数，同时收集、超声消化两组细胞制备成悬液，利用全自动生化仪测定胞内甘油三酯含量。结果见图3。2结果分析油红O染色显示在整个刺激分化过程中，过表达NYGGF5蛋白(通过转染使细胞表达了外源NYGGF5，采用蛋白鉴定予以了验证)的脂本文档来自技高网...
【技术保护点】
ＮＹＧＧＦ５蛋白在制备抑制脂肪细胞分化药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭锡熔，张敏，陈荣华，倪毓辉，彭宇竹，龚海霞，王玢，刘峰，辜楠，范红旗，邱洁，池霞，费莉，潘晓勤，郭梅，钱玲梅，夏黎，顾筱琪，韩树萍，刘茹，童梅玲，
申请(专利权)人：郭锡熔，张敏，陈荣华，倪毓辉，彭宇竹，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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