多巴胺受体新亚型Ｄ５Ｂ基因及编码的蛋白与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种多巴胺受体的新亚型Ｄ５Ｂ。通过ＰＣＲ方法得到与多巴胺受体Ｄ５相似的一个新亚型Ｄ５Ｂ基因，它能编码一个含４７８个氨基酸的Ｇ－蛋白偶联受体；与Ｄ５受体相比，Ｄ５Ｂ受体对多巴胺亲和性更高。这一新亚型可作为开发精神、神经疾病、心脏血管、肾病药物的重要靶点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，尤其是涉及一个多巴胺受体新亚型的基因及编码的蛋白与应用。
技术介绍
某些神经精神病(包括Parkinson病、精神分裂症、药物依赖、偏头痛、狂躁、抑郁症和抽动秽语综合征等)、心血管疾病、肾病与多巴胺受体有关，多巴胺受体在中枢神经系统中表达，控制运动功能、情绪、内分泌生理系统。人们对多巴胺及其受体的作用位置进行了大量的研究。Cools和Rossum通过电生理实验和药理实验提出可能大脑中不止存在一种多巴胺受体，这是多巴胺研究的一个里程碑。20世纪70年代，基于第二信使分析人们研究多巴胺受体，例如cAMP的刺激，以及基于结合分析，都支持不止一个多巴胺受体的思想。1979年Kebabian和Calne在他们的一篇综述中为这种思想奠定了基础，在他的论文中，扩展了Spano的提法，指出多巴胺受体有两类，D1和D2，有不同的生化和药学特性，调节不同的生理功能。D1和D2两个G-蛋白偶联受体作用的G-蛋白和效应器及相关的通路是不同的。尽管生化研究说明这些受体亚型有多么不同，然而，直到20世纪80年代，利用克隆技术，通过对多巴胺受体的克隆，才揭示出这些受体的真正的不同程度。结果表明，至少有5个多巴受体，分为两个亚族，其性质分别类似于通过生化和药理学定义的D1和D2受体，这两个亚族分别称为D1样受体(D1和D5)和D2样受体(D2，D3，D4)。多巴胺是基底核的主要神经递质，在运动控制和认知功能方面起着非常重要的作用。特别是D1样受体(D1和D5)受体。最近，D1样受体在大脑功能，尤其是在学习和记忆方面的功能，引起了人们巨大的兴趣。D1样受体的刺激太大或太少都会损害工作记忆。D1受体可能调节认知、影响Parkinson病。D1受体是前额皮质工作记忆关键的神经调节的影响因素，这个区域受许多神经疾病的影响。多巴胺受体为单链蛋白，它的N端在双层类脂膜外侧，C端在膜内侧，在双层类脂膜的中间有7个疏水的跨膜区(TMD)。膜外侧和膜内侧各有3个片段，分别称为外三环(E1-E3)和内三环(11-13)，它们把各个TMD联接起来；膜外侧有2-3个糖基位点，和其稳定结构作用的双硫键。七个跨膜螺旋束在一起在膜上形成配体的结合位点。激动剂可能结合到疏水性的TM结构域上，蛋白质的中央，氨基酸残基高度保守，行成一个狭窄的结合口袋，可能是激动剂的结合位点。C未端可能有一些棕榈酰残基，能形成与膜更多的连接。与D2样受体相比，D1样受体N端为2个糖蛋白；膜内侧第三环小一些，而C端肽链很长。在脑中，D1受体比其它多巴胺受体的分布广、表达高，在纹状体、伏隔核(nucleus accumbens，NAc)和嗅结节能检测到D1的mRNA，此外，在边缘系、海马和丘脑也检测到D1受体。在内茎核(entopeducular nucleus)、黑质网状部(substantianigra pars reticulata)，D1受体有高水平的表达，但却检测不到mRNA，说明在这些区域D1受体主要以投射存在。D5受体与D1受体相比，在大鼠中的表达要少得多，其表达限于海马、内侧乳头核(1ateral mamillary nucleus)、丘脑的束旁核。在某些嘴侧前脑(rostral forebrain)区域包括大脑皮层、背侧丘脑、斜角带、纹状体能检测到D5受体的mRNA，在黑质、中丘脑和海马能检测少量D5受体的mRNA。用D1和D5抗体检测这两个受体在灵长类动物的脑组织中不同区域的细胞和亚细胞分布，结果表明，D1和D5受体在前额页、前运动皮质(premotor cortex)、扣带皮质、内嗅皮质的锥体神经元以及海马和齿状回中共同表达。在前皮质和海马，D1和D5受体存在于突触前和突触后。在单个的锥体神经元中，D1受体主要集中在树突刺上，而D5主要集中树突骨干上。在嗅球，D1受体限于粒状层、网织层和插入到底外侧核的杏仁体。在尾状核，D1和D5主要位于中等大小的GABAA神经元。D5还存在于类胆碱能中间神经元，而D1不存在。D1受体存在于刺突触后到非对称突触的区域。D1和D5都位于具有多巴胺末端小突触特征的后突触密度。突触前D1和D5受体在轴突上形成不对称突触区。D1位于内茎核，黑质网状部，而D5检测不到，因此，如果D1和D5受体位于有尾的中等突刺神经元，也只有D1受体被转送到纹状体黑质末端。D1受体和D5受体在细胞和亚细胞水平上的位置不同，表明D1和D5受体虽然在药理学上是相同的但其功能上不是完全一样的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的多巴胺受体D5的亚型基因以及编码的蛋白。D5亚型与海马乙酰胆碱释放的调节有关。乙酰胆碱是一种神经递质，参与各种认知过程。D5亚型参与纹状体的信息的整理，能与gamma-氨基丁酸A(GABAA)受体相互作用，两个受体相互抑制其的功能。另外，D5受体调节与血压相关的信号通路，介导血压的响应，其功能对了解人类高血压产生的机制非常重要。可能还存在没有克隆的D1样受体。其中一个问题是，目前克隆的D1样受体能否偶合磷酸肌醇(PI)的水解，尚不清楚。然而，肾中的D1样受体与PI的水解有关，据报道，D1受体能偶合PI水解。在纹状体，D1偶合PI的更新，不过，仍有争论。另一个争议的问题是，在肾中只检测到低水平的D1受体的mRNA，不能解释为什么在肾组织中D1激动剂有相对高的结合水平。最后，有些实验也揭示，在肾皮质膜或肾衍生的细胞上，与D1选择性激动剂(尤其是SCH23390)的结合存在两阶段的结合曲线。所有这些，说明还可能存在一个没有识别的亚型。通过PCR方法，以人类基因组DNA和人类SHSY5Y细胞的基因组DNA为模板，筛选到D5受体和与之相似的另一个受体，称为D5B，并对这一基因进行了分析，序列如SEQ ID No.1所示。Blast分析的结果显示，该基因与D5受体(如SEQ ID No.2所示)98％相同，与D5的两个假基因94％相似。而D5与两个假基因D5ψ1(如SEQ ID No.3所示)和D5ψ2有95％的相同，两个假基因之间98％相同，D5B更接近于D5。通过对D5B、D5和D5一个假基因D5Ψ(GenBank data base M67440)的序列比较分析发现，在D5B中，与D5不同的地方总是与D5的假基因相同，与D5的假基因不同的地方总是与D5相同，特别是在COOH端，增加的碱基及其周围与D5的假基因完全一样。我们对照了D5B、D5和D5一个假基因D5Ψ(GenBank data base M67440)的序列，分析核酸测序的结果如下。编码区不同的氨基酸标注在D5序列上，破折号表示在这个位置上缺失，展开的∧符号表示在这个位置上插入，七个推测的跨膜结构域(TMDs)加上框并标记字母I-VII。推测的N糖基化位点用*标记，蛋白激酶A的磷酸化位点用上划线标记，蛋白激酶C的磷酸化位点用虚上划线标记，一个实方盒表示棕榈酰化的半胱氨酸。 这个核酸序列93.6％与D5一致，但它含有一个框内终止子(用圆圈标出)，因此不能合成功能蛋白受体。分析D5B的序列可以发现它有一个开放阅读框，编码一个含478个氨基酸的G-蛋白偶联受体(比D5多一个氨基酸Glu432谷氨酸)，是一个有功能的基因。分析这三个序列，发本文档来自技高网...

【技术保护点】
多巴胺受体Ｄ５Ｂ的基因，是下列核苷酸序列之一：ａ）序列表ＳＥＱＩＤＮｏ．１；ｂ）编码序列表ＳＥＱＩＤＮｏ．２蛋白质序列的多核苷酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许治良，江南，胡应和，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]