在哺乳动物细胞中表达凝血因子8的一种新的重组质粒制造技术

在细胞中高水平表达凝血因子８的一种新的重组质粒，其调控元件由ＣＭＶ的启动子与一个８碱基的增强子构成，８因子中Ｂ链的ＤＮＡ序列由一稳定短肽（ＳＦＳＱＮＳＲＰＰＶＬＫＲＨＱＲ）的ＤＮＡ序列取代。将该质粒导入哺乳动物细胞后，转基因细胞能稳定高效地表达有活性的凝血因子８。

【技术实现步骤摘要】
血友病是遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，包括8因子缺乏的血友病A、9因子缺乏的血友病B及10因子缺乏的血友病C，以血友病A最为多见。发病率为万分之1～2。8因子是分子量为330千道尔顿的糖蛋白，它是血液凝固过程中的一个重要因子。该蛋白由三个区域构成由A1链与A2链构成的N端区，中心的B链区及由A3、C1和C2链构成的C端区。凝血因子的基因位于X染色体上，其发病机理是X染色体上的凝血因子基因发生了突变，导致血浆中该凝血因子含量或活性大幅度下降，从而使得内源性凝血途径受到阻碍，无法进行正常凝血，所以血友病患者需终身用药。血友病的药物有两大类。一是传统的血制品提纯物，从血液中提取和纯化凝血因子，由于它存在着血浆中各种感染因子污染的危险，如肝炎病毒、爱滋病毒、血栓因子等为血友病患者的输血感染埋下了极大的隐患。为此，近年推出了另一类药物，即基因重组凝血因子。由于其安全性，且不需要紧缺的血浆作为原料，在年销售13亿欧元的凝血药物中已占有半数份额，占有率正以每年8～12％的速度增长。目前世界上能够生产基因重组凝血因子的制药公司只有四家BAXTER、AVENTIS、WYETH和BAYER。国内尚属空白。本专利技术涉及基因重组凝血因子8生产的关键环节，即在哺乳动物细胞中高水平表达凝血因子8的一种新的重组质粒，其调控元件由CMV启动子与增强子构成，8因子中B链的DNA序列由一稳定短肽的DNA序列取代。将该质粒导入哺乳动物细胞之后，转化细胞能稳定高效地表达有活性的凝血因子8。本专利技术包括以下几项技术1、启动子的修饰将CMV启动子与增强子构件成重组的调控元件。2、将一稳定短肽的DNA序列取代精氨酸与谷氨酸之间的长B链DNA(740至1649)3、哺乳动物细胞的转化。4、凝血因子8的活性检测。5、凝血因子8的蛋白定量测定。实施例1启动子的修饰用内切酶EcoRv将增强子(TGACGTCA)序列插入到8因子起始密码(ATG)前30bp的位置，(附图1)经修饰的启动子能增强8因子在CHO细胞中的表达水平。实施例2重组质粒的构建从完整的人的肝细胞RNA库逆转录获得8因子的cDNA序列。然后用设计有内切位点的探针，通过PCR技术分别扩增两个DNA序列，一个是8因子的A1+A2·序列，一个是8因子的A3+C1+C2序列，分别建成质粒pCRA1A2与pCRA3C1C2，设计中在A2与A3之间保留了B链的一个16氨基酸(SFSQNSRPPVLKRHQR)短肽的DNA序列(附图2)，再从pCRA3C1C2切下SaII/SmaI片段插入到pCRA1A2的SaII位点，从而获得了质粒pCRA1A2A3C1C2(附图3)，最后将pCRA1A2A3C1C2质粒的NotI/XhoI片段连接到PspOMI质粒的NotI粘性末端，最终形成编码4.3kb人8因子的真核表达载体质粒(附图4)实施例3.细胞转化将中国仓鼠卵巢细胞(CHO)以低密度接种到10cm平皿的6mlCD-3+10％FCS培养基中，按照Chen与Okayama(Mol.Cell.Biol，1987，72745)的方法，用12微克的pcFVIII质粒转染，6小时后用新鲜培养液置换掉原培养基，3天后收集上清液进行析。实施例4.凝血因子8的活性检测用COAMATICFVIII显色试验(Chromogenix，Instrumantation Laboratory Company-LexingtonMA 02421-3125USA)检测8因子的瞬间表达活性每个样品取50微升移入96孔板中，在37℃下培育4分钟后加入50微升试剂，在37℃下再培育2分钟。然后再加入50微升S-2765+I2581试剂，在37℃下培育2分钟。最后加入50微升20％的乙酸，以终止反应。样本即刻用Dynex光度计在405nm处测定吸收光谱，从凝血时间差异可以检测出8因子的活性。(附图5)实施例5. 凝血因子8的蛋白定量测定用美国的IMUBIND fVIII ELISA诊断Kit(LotNo.022201)检测转化体上清液的8因子水平。1、将100微升的测试液加到孔穴中，加盖后在室温下培育90分钟。2、洗涤按照微孔板洗涤程序2洗孔穴，每穴用250微升洗涤缓冲液洗4次。3、检测抗体的培育将100微升抗体的1％稀释液加到每个穴中，加盖后在室温下培育60分钟。4、第二次洗涤同首次洗涤。5、底物反应100微升的底物溶液立即加入到每穴中，加盖后在室温下培育20分钟。6、终止反应每穴中加50微升0.5N H2S04以终止反应。7、检测黄色反应产物在450nm处读数，8因子ELISA测定值的校正曲线由附图6显示。 附图说明图1显示启动子的修饰图2显示取代B链的短肽序列图3显示重组质粒的构建图4显示本专利技术的载体质粒pcFrVIII图5显示重组hFVIII的凝血活性，纵坐标为凝血时间图6显示凝血因子VIII的ELISA标准曲线。与本专利技术有关的参考资料1.Xu Z-L，Mizuguchi H，Ishii-Watabe A，Uchida E，Maymi T and Hayakawa TOptimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors.Gene2001，272149-1562.Kozak MAt least six nucleotides proceding the AUG initiator codon enhance translation inmammalian cells.EMBO J.1997，162482-24923.Wood WI，Capon DJ，Simonsen CCExpression of actiVe hnman factor VIII fromrecombinant DNA clones.Nature 1984，312330-3374.White GC，Courter S，Bray GLA multicemer study of recombinant factor VIII(recombinate)in previously treated patients with hemophilia A.Thromb Haemost 1997，77660-6675.Vehar GA，Keyt B，Easton Dstructure of human factor VIII.Nature 1984，312337-4326.Sandberg H，Almetedt A，Brandt J，et alStructural and functional characteristics of a B-domain deleted recombinant factor VIII molecule，r-FVIII SQ.Thromb Haemost 2001，8593-1007.Lind P，Larsson K，Spira JNovel forms of B-domain-deleted recombinant factor VIIImolecules.Construction and biochemical characte本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达凝血因子８的重组质粒，含有ＣＭＶ启动子与一８碱基增强子构成的调控元件，８因子中Ｂ链的ＤＮＡ序列由一稳定短肽（ＳＦＳＱＮＳＲＰＰＶＬＫＲＨＱＲ）的ＤＮＡ序列取代，其特征在于被该质粒转化的哺乳动物细胞能稳定高效地表达有活性的凝血因子８。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：顾文勇，孙勇如，闫蕴力，冷炜，
申请(专利权)人：顾文勇，孙勇如，闫蕴力，冷炜，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]