本申请涉及蛋白转导域－人酪氨酸羟化酶催化区域的融合蛋白，以及编码该融合蛋白的核酸。本申请也涉及所述融合蛋白的表达纯化及复性方法。本申请也提供含有所述蛋白转导域－人酪氨酸羟化酶催化区域融合蛋白的药物组合物，所述组合物可以用于治疗帕金森病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和药学领域。具体地涉及蛋白转导域-酪氨 酸羟化酶催化区域融合蛋白和应用。
技术介绍
由于血脑屏障的选择性通透作用，使许多治疗脑部疾病的药物不能直接到达脑部病变部位，限制了其对疾病的治疗。帕金森病(Parkinson' s disease, PD)是一种老年人常见的慢性 进展性运动障碍性疾病，其临床表现以静止性震颤、肌强直、运动迟 緩和姿势反射障碍为特征。PD的病理改变主要为黑质致密部多巴胺 (Dopamine, DA)能神经元严重缺乏，其生化改变主要为黑质、紋状体 DA递质减少。目前最有效的治疗措施是口服补充DA的前体物质左旋 多巴，但一般服药3-5年后疗效显著下降并出现毒副作用。酪氨酸羟 化酶是儿茶酚胺类活性物质生物合成的限速酶，其催化活性残基都位 于其C-端的330个氨基酸中，在N-端的氨基酸中没有与催化活性有关 的氨基酸。研究表明，蛋白转导域(protein transduction domain, PTD)能够有效地通过生物膜，将外源蛋白质与PTD连接后，能够进入 细胞和通过血脑屏障。将PTD的转导特性应用于药物治疗疾病方面， 具有重要的临床价值。本专利技术的目的，在于制备PTD-酪氨酸羟化酶催化区域融合蛋白， 以期在临床治疗中，提高药物到达病变部位的量，更好地发挥治疗作 用。
技术实现思路
在一方面，本专利技术提供一种蛋白转导域-人酪氨酸羟化酶催化区域的融合蛋白，其中的蛋白转导域能引导人酪氨酸羟化酶催化区域通 过血脑屏障，从而使酪氨酸羟化酶催化区域在不需进行外科手术情况 下到达脑部发挥活性。满足这一要求的蛋白转导域可以是HIV-1反式激活蛋白 (trans-activator transcription, TAT)中的蛋白转导区(protein transduction domain, PTD)、果蝇触角蛋白同源结构域(ANTP )和 单纯疱渗病毒(HSV)VP22蛋白的蛋白转导序列。特别是具有序列 YGRKKRRQRRR ( SEQ ID NO: 1)或其功能性片段的PTD,本专利技术融合蛋白中的人酪氨酸羟化酶催化区域优选具有下述序列 ( THc ) :(SEQ ID NO: 2)或其功能性片段。更优选的，本专利技术的融合蛋白具有下述序列:ELDTLAHALSAIG (SEQ ID NO: 3 )，其中1) 残基1-11为HIV-1的反式激活蛋白的47-57位肽；2) 残基12-14为连接序列；3) 残基15-367为THc序列。另一方面，本专利技术提供了编码所述融合蛋白的核酸序列。在上述公开的氨基酸序列基础上，本领域普通技术人员能很容易地确定编码本专利技术融合蛋白的核酸序列。所述核酸序列优选具有下列序列TATGGTCGTAAAAAGCGACGCCAACGTAGACGTGAATTCCTGCTCAGTGGTGTGCGCCAGGTGTCAGAGGACGTGCGCAGCCCCGCGGGGCCCAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAAATTGAGAAGCTGGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGCCTGTCTGAGG AGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTACCAAGACCAGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTCCAGGAT 中1) 残基1-33编码HIV-l的反式激活蛋白的47-57位肽(TAT );2) 残基40-1101为TH催化区域序列；3) 残基1102-1104为终止密码子序列。此外，本专利技术也提供了含有上述核酸序列的表达载体。 本专利技术还涉及所述融合蛋白的表达、纯化及复性方法，包括将编 码所述融合蛋白和His标签的质粒如pET质粒转化宿主菌BL21 (DE3)， 培养在25X: 42C，取出活化菌液，以5% ~ 20%的比例在新鲜培养基中培养至OD600值为0.5~2. 0，加入浓度为0. 4~lmM的i秀导剂 IPTG，诱导时间为3-24h，收集诱导表达的菌体，PBS洗净，用pH8. 5 ~ 11. 5的10mmol/LTris緩沖液重悬菌体，振荡混匀，置冰上超声10 ~ 15min破菌，然后回收包涵体。用6-10M尿素溶解，用镍柱或层析柱 纯化包涵体。采用连续梯度法复性目的蛋白。还在另一方面，本专利技术提供了所述融合蛋白用于制备治疗帕金森 病或其他儿茶酚氨类缺乏疾病的药物中的用途。本专利技术特别涉及含有 所述融合蛋白的药物组合物，为选自适于静脉注射、肌肉注射、皮下 注射、舌下含服、肺吸入、鼻腔粘膜、肛栓或皮肤吸收及其它给药方 式施用的剂型或滴眼液剂的剂型。附图说明 图1: pET-PTD-hTHc构建示意图2: pET-PTD-hTHc经BamHI和Sal I双酶切鉴定，其中 标签l:pET-TH; 2: pET-PTD-TH; 3: pET-THc; 4: pET-PTD-THc; M: DM标准；图3: pET-PTD-THc表达结果,其中标签l，含pET28a菌；2， pET-THc; 3， pET-PTD-THc; 4， pET-TH; 5， pET-PTD-TH; M，标准蛋白分子量；图4: pET-PTD-THc Western结果，其中标签1, pET-TH; 2， pET-THc; 3， pET-PTD-TH; 4， pET-PTD-THc图5: PTD-THc透过SH-sy5y细胞膜实验，其中A:生理盐水对照；B: PTD-TH; C: THc对照；D: PTD-THc;图6:尾静脉注射PTD-THc透过大鼠血脑屏障实验，其中A:生理盐水对照；B: PTD-TH; C: PTD-THc;图7: PTD-THc对PD大鼠旋转行为的影响。实施例本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，其由蛋白转导域（ＰＴＤ）和人酪氨酸羟化酶催化区域（ｈＴＨｃ）组成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴少平，孙曼霁，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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