在转基因水稻中高效生产木聚糖酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种在转基因水稻中高效生产木聚糖酶的方法，本发明专利技术的技术方案是构建含有木聚糖酶重组基因的、能在植物中高效表达的载体，利用农杆菌介导转化水稻幼胚或成熟胚诱导形成的愈伤组织，得到转基因植株，使木聚糖酶在转基因植株的茎、叶和种子中表达。采用本发明专利技术方法获得的转基因水稻是富含木聚糖酶的饲料稻品种，转木聚糖酶基因水稻的谷粒可用于单胃动物饲料，稻叶和秸秆可以作为反刍动物饲料，可方便直接地用于饲料中而无需在饲料中添加通过发酵技术生产的木聚糖酶添加剂，提高谷物饲料转化效率，大幅度降低饲料成本，经济效益十分显著。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物基因工程领域中利用转基因植物生产酶制剂的方法，尤其 是涉及利用转基因水稻生产木聚糖酶的方法。
技术介绍
我国是世界上饲料原料需求大国，随着词料粮总需求量不断增加，其缺口 也逐年增大。我国养殖业的能量词料资源十分短缺，而作为我国大宗粮食作物 一水稻的秸秆和谷粒由于富含木聚糖等抗营养因子词用效率低下。谷物饲料中的木聚糖是一种不能被单胃动物消化吸收的抗营养因子(Bedford ,1995; Choct 等，1990)，在动物胃肠道的消化吸收过程中与金属离子、蛋白质和一些营养物 质结合成不易被吸收利用的物质，不仅增加饲料成本还降低了动物的生产性能。 我国是世界上最大的养殖国之一，动物在将词料营养转化为畜产品的过程 中，有很多食入养分未吸收而被排入到环境中去，对土壤和水源造成巨大污染(N、 P的污然最为严重)。我国每年产生禽畜粪便10多亿吨，养殖业对生态环 境造成了很大威胁。如何通过饲料改良减轻动物粪便造成的污染问题，是农业 和畜牧业可持续发展需要解决的迫切问题。木聚糖酶(EC3.2丄8)能水解谷物和秸秆中的木聚糖，在半纤维素降解中 起着关键作用，可大幅度提高纤维素类物质的利用效率，具有广泛应用前景(Biely， 1985;孙建义，1998)。研究表明，在肉鸡饲料中添加含木聚糖酶的酶 制剂能提高饲料转化效率和生长速率10%以上，木聚糖酶能提高稻谷不同养分 消化率7.16%-96.46%;肉鸡生长速度和词料转化效率分别提高了 17.1-20.0%和 15.2-15.9%，并接近玉米饲料水平(李卫芬等，1999; 2004;王敏奇等，2003)。 木聚糖酶主要作用机理通过有效降解谷物饲料细胞壁中的木聚糖，使胞内营 养物质释放出来，有利于动物消化酶分解；并通过消化酶活性的提高和消化道 内容物粘度的降低，维持消化道正常形态结构，提高饲料养分的消化吸收率， 减少大肠杆菌数量使畜禽的腹泻率大幅度降低，促进动物健康生长；从而提高谷物饲料转化效率，接近玉米相同的饲养效果，并大幅度降低饲料成本， 提高养殖业的饲料报酬。此外，还具有减少畜禽排泄物中有害物质(氮和磷)排放量和代替抗生素的功效，经济效益十分显著(Bedford ,1995; Choct等，1995)。 因此世界各国尤其发达国家均普遍使用微生物酶制剂来提高养殖业的经济效益 (Cassen,1996;居乃琥，2000)。目前用于提高饲料利用率的木聚糖酶均来自微生物(Wong等，1988;刘 明启等，2004)， 一般采用微生物发酵系统生产木聚糖酶，但其使用成本仍然 较高，从而制约了木聚糖酶的广泛应用(Kimura等，2003)。利用植物表达系统生产酶制剂是近年发展起来的生物新技术，主要是釆用 特异启动子诱导外源重组酶基因在农作物中高效表达，使农作物的茎、叶或种 子等组织富含重组酶。利用该技术获得的农作物新品种不仅可大规模生产酶制 剂，而且其秸秆和/或种子可加工优质饲料，从而降低养殖业生产成本，大幅度 提高生产效率(Goddijinetal.， 1995, Hellwig et al.， 2004; Whitelam，1995)。已有的研究表明，利用转基因模式植物一烟草作为生物反应器开展的微生 物木聚糖酶基因转导及表达研究己经获得成功(Sun等，1997;Herbers等，1995; 1996) 。 Herbers等人(1995， 1996)将热纤梭菌木聚糖酶XynZ和瘤胃微生物 木聚糖酶D导入烟草表达，且没有危害烟草的生长。微生物木聚糖酶也在油菜 籽中获得了表达，它定位于油菜种子中的油质体膜上，实现了外源基因与植物 油体特异调控基因的融合表达(Liu等，1997) 。 2000年澳大利亚的Patel等人 将瘤胃真菌木聚糖酶基因(xynA)导入大麦胚乳中表达，这些研究表明利用微 生物木聚糖酶基因在植物中的高效表达来生产木聚糖酶是一条可行的技术途 径。但是有关微生物木聚糖酶在其它农作物中表达的研究很少。鉴于水稻是我 国重要的农作物，将来源于微生物并经过人工修饰能耐受饲料制粒等高温加工 的木聚糖酶重组基因转移到水稻中表达，利用农作物如水稻的稻叶和秸秆来生 产饲用酶有广泛的应用前景，迄今为止，在国内外尚未见相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种在转基因水稻中高效生 产木聚糖酶的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案 一种转基因水稻中高效 生产木聚糖酶的方法，该方法包括以下步骤(1) 构建含有木聚糖酶基因的植物表达载体。(2) 用农杆菌介导得到转基因植株，使木聚糖酶基因在转基因植株的种子、茎 叶中表达。进一步地，所述步骤(1)具体为将木聚糖酶重组基因atx添加Ru3印片 段后，插入到植物表达载体pXYL06上，获得Atx-Ru3印-pXYL06载体，将载体 导入根癌农杆菌EHA105,获得工程菌Atx-EHA105，利用农杆菌介导的遗传转化 系统将木聚糖酶基因导入水稻基因组中。所述步骤(2)具体为利用农杆菌介 导的遗传转化系统，将木聚糖酶重组基因导入水稻基因组中，经过抗性筛选、 分化和生根培养获得了转基因水稻植株。本专利技术的有益效果是，本专利技术方法将来源于微生物并经过人工修饰能耐受 饲料制粒等高温加工的木聚糖酶基因转移到水稻中，并在水稻叶片、茎杆和种 子中高效表达，培育富含木聚糖酶的词料稻品种，可以大量、廉价生产木聚糖 酶。而且转木聚糖酶基因水稻的谷粒可用于单胃动物词料，稻叶和秸秆可以作 为反刍动物饲料，而无需在词料中添加通过发酵技术生产的木聚糖酶添加剂， 对于稻谷及其秸秆的开发利用具有重要意义，不仅提高农作物价值，而且可减 少作为"胶囊化木聚糖酶"饲料的转基因作物在单位饲料中的使用量，降低饲料成 本。无论从经济角度还是使用方便的角度来说，都更具优势。优势如下1、原 材料通过农业方式获得，生产成本低廉，水稻的谷粒和秸秆均可以直接饲喂动 物或加工饲料；2、相对于发酵的方法，使用植物生物反应器，无需发酵工艺设 备，大大降低资本投资；3、水稻是我国重要的农作物，生产规模可以迅速扩大。附图说明图1是表达载体pXYL06的物理图谱；图2是PCR扩增得到的木聚糖酶基因电泳图谱，图中，l为标准分子量，2 为木聚糖酶基因(640bp);图3是表达载体的酶切电泳图，图中，l为标准分子量，2为pXYL06质粒， 3为pXYL06质粒，4为木聚糖酶基因(640bp) atx-Ru3ep- pXYL06载体 BamHl/Pstl双酶切；图4是用于转化的目的基因电泳图谱，图中，1为marker (100bp、 200bp、 300bp、 400bp、 500bp、 600bp、 700bp、 800bp、 900bp、 1000bp、 1200bp、 1500bp、 2000bp、 3000bp)， 2为atx-Ru3ep-pXYL06质粒(转化后的EHA105中抽提)，3为atx-Ru3ep-1301 EHA105菌液，4为阳性对照atx-Ru3ep-pXYL06质粒，5 为阴性对照pXYL06质粒，6为阴性对照EHA105菌液；图5是再生植株PCR检测木聚糖酶基因的电泳图，图中，1为marker, 2 为阳性质粒，3为野生水稻，4-8为转基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在转基因水稻中高效生产木聚糖酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（１）构建含有木聚糖酶基因的植物表达载体。　（２）用农杆菌介导得到转基因植株，使木聚糖酶基因在转基因植株的种子、茎叶中表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：翁晓燕，孙建义，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]