一种循环肿瘤细胞分离微流控芯片装置制造方法及图纸

本实用新型专利技术涉及一种循环肿瘤细胞分离微流控芯片装置，该装置包括微流控芯片(1)和芯片夹具(2)，微流控芯片(1)包括芯片入口(11)、单螺旋芯片(12)、稀有细胞收集管道(13、14)和白细胞出口(15)，单螺旋型通道从圆形螺旋通道中心的芯片入口(11)，经半圆形起始通道，进入螺旋形微流控通道，末端包含3个出口：分别收集不同粒径大小稀有细胞；芯片夹具(2)自动对接微流控芯片(1)出入口。与现有技术相比，本实用新型专利技术微流控芯片装置可自动对经处理后样品进行自动化高通量肿瘤细胞分离、富集肿瘤病人外周血/胸腔积液/脑脊液等液体样本中的肿瘤细胞，显著提高了肿瘤患者断准和个性化治疗特异性和准确性。

A microfluidic chip device for circulating tumor cell separation

The utility model relates to a circulating tumor cell separation microfluidic device, the device comprises a microfluidic chip (1) and (2), chip fixture microfluidic chip (1) including chip entrance (11), single spiral chip (12), rare collection of cells (13, 14) pipeline and export of white blood cells (15), a single spiral channel from the center of the circular spiral channel chip (11), after the entrance of semicircular starting channel, into the spiral microfluidic channel, terminal contains 3 exports were collected for different sizes of rare cells; (2) automatic chip fixture to connect the microfluidic chip (1) entrance. Compared with the prior art, the utility model has the advantages of microfluidic devices can be automatically processed samples were enriched for tumor patients, automated high-throughput separation of tumor cells in peripheral blood / pleural effusion / cerebrospinal fluid in liquid samples of tumor cells significantly increased the tumor patients off quasi and personalized treatment specificity and accuracy.

【技术实现步骤摘要】
一种循环肿瘤细胞分离微流控芯片装置
本技术涉及细胞分选领域，具体的说是涉及一种在微流控芯片上从生物液体样本中进行自动分选循环肿瘤细胞的装置。
技术介绍
在生物医学等领域，经常需要从较为复杂的样品中，分选出特定的目标细胞。如检测、分选并计数癌症患者血液中的循环肿瘤细胞(CTC，circulatingtumorcell)的个数在在癌症诊断与治疗中显得愈发重要。目前CTC检测技术鱼龙混杂，总体上就是利用和不利用标记物两大类，基于标记物捕获的通常包括抗体包被磁珠为基础的阳性富集法和阴性富集法。此类属于第一代CTC捕获技术，代表为强生的Cellsearch系统。但其技术缺陷在于抗体捕获仅局限于对特异表达EpCAM上皮抗原的上皮来源CTC的捕获，并且无法实现活细胞捕获进行后续基因检测。阴性富集法通过CD45磁珠反向去除外周血中白细胞，该方法无法对大体积样本中的微量CTC进行富集检测，以及存在磁珠的非特异性吸附问题。第一代技术过滤膜法只能捕获大粒径肿瘤细胞，漏检小粒径肿瘤细胞，而且捕获的细胞没有细胞活性，只能用于细胞计数、形态学、以及FISH检测。微流控芯片被喻为21世纪生命科学的支撑技术，是便携式生化分析仪器的技术核心。该技术是通过构建微尺度的通道，将生物和化学等领域所涉及的样品制备、生物与化学反应分离与检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，能够在短时间内分析大量的生物分子，准确获取样品中的大量信息，信息量是传统检测手段的成百上千倍。在微流控芯片上对血液样品中的循环肿瘤细胞进行分选已有一些研究的报道，如利用介电泳、流体动力、基于免疫磁珠和荧光分选法等。但该方法都存在不同程度的不足，如直流介电泳的方法需要施加较高的电场强度，极容易造成细胞裂解；基于免疫磁珠分离方法虽然提高了对特定抗原表达肿瘤细胞分离效率，但仍然局限于对肿瘤细胞抗原表位的识别，而循环肿瘤细胞异质性决定了采用单一抗体或几种抗体进行基于抗原识别的捕获方法，都存在对非抗原表达CTC的漏检问题。而荧光分选的方法需要对细胞进行荧光标记，并且需要搭建复杂的光学检测系统。专利201410336948.4公开了一种循环肿瘤细胞分离PDMS微流控芯片，包括储液孔A至储液孔F、检测通道、主通道、第一、第二聚焦通道、样品出口通道、目标细胞收集通道、电磁分选通道；当循环肿瘤细胞通过检测通道时，产生的电压信号被检测到并被送至NI采集卡和处理终端，处理终端通过NI采集卡发出电压信号，使电磁继电器闭合，继而使电磁微阀结构压迫其下方PDMS层，使其发生形变，从而从储液孔E排出一部分液体，推动循环肿瘤细胞流入目标细胞收集通道中。该芯片装置需要电场和磁场装置实现细胞的分离。该芯片整体制备复杂、操作流程多且成本高。专利201410345305.6公开了一种双螺旋微流控芯片，其包括红细胞出口、白细胞出口、流体出口和细胞滤膜，根本上还是依赖于8微米孔径过滤膜实现对肿瘤细胞过滤分离，此类方法仍然会漏检小粒径肿瘤细胞。
技术实现思路
本技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种循环肿瘤细胞分离微流控芯片装置。本技术基于循环肿瘤细胞和血细胞核质比和表面电荷上的差异，在微流控芯片上采用流体力学实现对样品中循环肿瘤细胞的非抗体依赖的分离富集。本技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种循环肿瘤细胞分离微流控芯片装置，其特征在于，该装置包括微流控芯片和芯片夹具，所述的微流控芯片包括芯片入口、单螺旋芯片、稀有细胞收集管道和白细胞出口，其中，所述稀有细胞收集管道包括两根，分别连接内侧出口(13)和出口(14)；所述的单螺旋芯片由单螺旋型通道构成，所述单螺旋型通道从圆形螺旋通道中心的芯片入口，经半圆形起始通道，进入螺旋形微流控通道，末端包含3个出口：分别收集不同粒径大小稀有细胞的出口(13)和出口(14)，以及收集白细胞的废液出口(15)；所述的芯片夹具自动对接微流控芯片的芯片入口、稀有细胞收集管道和废液出口。所述的内侧出口的宽度为110±50μm，出口的宽度为110±50μm，白细胞出口的宽度为700±100μm。所述的CTC收集管道出口(13)和出口(14)均采用正电荷聚合物进行表面涂层处理。所述的正电荷聚合物为阳离子聚合物，包括聚乙烯亚胺、丙烯酰胺经改性后的两亲性聚合物。所述的单螺旋型通道为主通道，其宽度为500±100μm，高度为120±50μm，每个单一螺旋间距为500±100μm，完整螺旋数大于等于3。所述的芯片夹具包括样品管接头、CTC收集管接头和废液收集管接头；合上芯片夹具，所述的样品管接头与芯片入口对接，所述的不同粒径CTC收集管接头与所述出口(13)、(14)对接，所述白细胞收集管接头与所述出口(15)对接，使微流控芯片的各出入口和外接导管连接，其中所述样品管接头另一端连接生物样品，通过注射泵或者压力泵装置将生物样品恒速注入芯片装置，其流速为50-300ml/h。将生物样品恒速注入芯片装置的流速优选为60-200ml/h。所述的流速更优选为100ml/h，120ml/h或者150ml/h。所述生物样品为外周血、末梢血、胸腔积液、腹腔积液、脑脊液、骨髓液和/或尿液。一种循环肿瘤细胞分离微流控芯片装置的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测血样采用红细胞裂解液(该红细胞裂解液为市售产品，如采用无锡纳奥生物医药有限公司生产并销售的裂解液)裂解处理后，加入PBS缓冲液，稀释为进样样本；(2)通过配套注射泵或压力泵装置，将步骤(1)中进样样本通过导管从芯片夹具的样品管接头注入微流控芯片的芯片入口，根据细胞核质比和表面电荷的差异在单螺旋芯片内实现循环肿瘤细胞的富集分离；(3)富集分离出的不同粒径CTC细胞从出口(13)、(14)流出，经CTC收集管接头及附带导管导出并接入无菌离心管中，白细胞从外侧白细胞出口流出经白细胞收集管接头及附带导管导出。步骤(1)所述的PBS缓冲液与待测血样的体积比为10～30:1。与现有技术相比，本技术生物样本在通过微流控芯片时，利用流体在螺旋流道中的惯性效应和Dean流作用，将肿瘤细胞和其它细胞聚焦在距离入口中心原点不同的位置，不同核质比和表面电荷的肿瘤细胞和白细胞，在流体力学作用下，汇聚成不同位置的平行线，在本技术限定的流速范围内，细胞会因其核质比和电荷的差异，承受不同的流体力，不同细胞在管道内形成空间上的差异排列，最终从不同的出口流出。其中，大部分的白细胞在汇聚成线后进入血细胞流道，大部分肿瘤细胞则通过结构流道中的电荷吸附作用分别进入CTC流道。采用上述螺旋流道惯性分选技术结构与电荷吸附技术集成的微流控芯片，克服了已有循环肿瘤细胞分离方法的集成度低、捕获率低等缺陷，实现对肿瘤细胞非抗体依赖的循环肿瘤细胞快速高通量分离；另外，本系统的芯片结构简单、加工方便，具有操作简单、自动化程度高等优，可用于稀有细胞生物学研究、疾病早期诊断与治疗等领域。附图说明图1为本技术的微流控芯片结构图；图2为本技术的芯片夹具开启结构图；图3为本技术芯片夹具闭合结构图；图4为本技术的微流控芯片对细胞分离的模拟示意图；图5为利用本技术微流控装置对添加到正常血液中的GFP转染的MGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种循环肿瘤细胞分离微流控芯片装置，其特征在于，该装置包括微流控芯片(1)和芯片夹具(2)，所述的微流控芯片(1)包括芯片入口(11)、单螺旋芯片(12)、稀有细胞收集管道和白细胞出口(15)，其中，所述稀有细胞收集管道包括两根，分别连接内侧出口(13)和出口(14)；所述的单螺旋芯片(12)由单螺旋型通道构成，所述单螺旋型通道从圆形螺旋通道中心的芯片入口(11)，经半圆形起始通道，进入螺旋形微流控通道，末端包含3个出口：分别收集不同粒径大小稀有细胞的内侧出口(13)和出口(14)，以及收集白细胞的外侧白细胞出口(15)；所述的芯片夹具(2)自动对接微流控芯片(1)的芯片入口(11)、稀有细胞收集管道(13、14)和白细胞出口(15)。

【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞分离微流控芯片装置，其特征在于，该装置包括微流控芯片(1)和芯片夹具(2)，所述的微流控芯片(1)包括芯片入口(11)、单螺旋芯片(12)、稀有细胞收集管道和白细胞出口(15)，其中，所述稀有细胞收集管道包括两根，分别连接内侧出口(13)和出口(14)；所述的单螺旋芯片(12)由单螺旋型通道构成，所述单螺旋型通道从圆形螺旋通道中心的芯片入口(11)，经半圆形起始通道，进入螺旋形微流控通道，末端包含3个出口：分别收集不同粒径大小稀有细胞的内侧出口(13)和出口(14)，以及收集白细胞的外侧白细胞出口(15)；所述的芯片夹具(2)自动对接微流控芯片(1)的芯片入口(11)、稀有细胞收集管道(13、14)和白细胞出口(15)。2.根据权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞分离微流控芯片装置，其特征在于，所述的内侧出口(13)的宽度为110±50μm，出口(14)的宽度为110±50μm，白细胞出口(15)的宽度为700±100μm。3.根据权利要求1所述的一种循环肿瘤细胞分离微流控芯片装置，其特征在于，所述的内侧出口(13)和出口(14)均采用正电荷聚合物进行表面涂层处理。4.根据权利要求3所述的一种循环肿瘤细胞分离微流控芯片装置，其特征在于，所述的正电荷聚合物为阳离子聚合物，包括聚乙烯亚胺、丙烯酰胺经改性后的两亲性聚合物。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：亓立峰，
申请(专利权)人：无锡纳奥生物医药有限公司，
类型：新型
国别省市：江苏,32