本发明专利技术公开了一种提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步骤进行：（１）食用油脂中极性成分的萃取，采用水作为萃取剂，用离心的方法进行油液分离；（２）萃取液的浓缩，全部转移萃取液于电热恒温干燥设备或其它干燥设备内，充分干燥；（３）食用油脂中ＤＮＡ的粗提；（４）粗提ＤＮＡ的纯化。本方法适用于初榨大豆油、菜籽油、玉米油，精炼大豆油、菜籽油、玉米油、多种调和油，以及花生油、芝麻油、橄榄油、棉籽油、棕榈油等食用油脂的适用于ＰＣＲ或相应下游实验的ＤＮＡ的提取。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
DNA提取技术的建立是保障PCR或相应下游实验顺利进行的关键，到目前为 止，保存较好的生物材料、加工或部分深加工生物材料基本均可做到利用生物技 术领域熟知的DNA提取技术(普通DNA提取试剂或利用市售特殊装置如纯化柱 法、磁珠法、超滤离心法等)顺利完成适用DNA的提取过程。就利用PCR等技术 进行下游实验而言，许多实验室经常遇到特殊的实验材料难以提取到适用于PCR 或相应下游实验的DNA的问题，食用油脂是该特殊实验材料中的一种。多年来， 国内外诸多相关实验室均力图建立可重复的、稳定的食用油脂中适用于PCR或相 应下游实验的DNA提取方法，但至今尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可重复的、稳定的食用油脂中适用于PCR的DNA 的提取方法。为了达到上述目的，本专利技术所述的提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步 骤进行(1) 食用油脂中极性成分的萃取 采用水作为萃取剂，用离心的方法进行油液分离；(2) 萃取液的浓缩全部转移萃取液于电热恒温干燥设备或其它干燥设备内，充分干燥；(3) 食用油脂中DNA的粗提；(4) 粗提DNA的纯化。上述步骤(1)中，在萃取过程中，必须采取离心等方法去除油水界面物质， 根据下层水相浑浊程度分多次共需萃取初搾大豆油约400 mL-600 mL、初搾菜籽 油约700 mL-1000 mL、初榨玉米油约700 mL-1000 mL、各种精练油约2000-3000mL、花生油、芝麻油等约400 mL-600 mL、棕榈油600 mL-800 mL。当待测油脂为初榨大豆油时，步骤(3)中DNA的粗提按照以下方法进行 取预热至约80-90°C CTAB提取液8-10 mL，分多次小心洗下表面皿上干燥的萃 取物，吸取洗下的萃取物转移至15mL离心管。加入等体积的船/氯仿/异戊醇， 充分震荡约30s， 7 500 Xg室温离心lO min;分别小心吸取上清至另一 15 mL 离心管，再次加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，操作同上，小心吸取上清，上清加 入0.2至0.3倍体积的预冷异丙醇，充分上下倒置混匀，置0。C约20-40min后 10 000-12 500Xg， 4。C离心6 min，沉淀置(TC待用；上清于27 000-30 OOOX g， 4。C离心10 min，弃取上清，沉淀加入500yL 70%_80%预冷的乙醇，充分上 下倒置混匀，27 000-30 000Xg， 4。C离心5 min，弃去上清，置核酸真空干燥 仪干燥；上述10 000-12 500Xg离心所获沉淀加入约1200 u L 70%_80%预冷的 乙醇，充分上下倒置混匀，27 000-30 000Xg， 4'C离心5min，弃去上清，置 核酸真空干燥仪干燥。当待测的油脂为初搾菜籽油、玉米油、花生油、芝麻油、棕榈油、棉籽油或 各种精炼油等时，步骤(3)中DNA的粗提按照以下方法进行取预热至约80-90 。C CTAB提取液8-10mL，充分溶解干燥的萃取物于15mL离心管，加入等体积的 酚/氯仿/异戊醇，充分震荡约30s， 7 500 Xg室温离心10 min;上清按1/10 体积加入3MNaAc，混匀，加入LA溶液，混匀，加入等体积异丙醇，混匀，-20 。C静置约40min-60min后，27 000-30 OOOXg， 4。C离心10 min，弃取上清，沉 淀加入500uL 70%-80%预冷的乙醇，充分上下倒置混匀，27 000-30 OOOXg， 4 'C离心5min，弃去上清，置核酸真空干燥仪干燥。所述步骤(4)粗提DNA的利用特制的长片段核酸富集纯化装置来进行，该长 片段核酸富集纯化装置包括一个筒状主体1，在两端开口端口包覆半透膜2，在 筒状主体上设有取液孔3和加样槽4，取样孔3带有胶塞5。在加样槽下方的部 分筒状主体内充填有琼脂糖凝胶，而取液孔下方的部分筒状主体保持为空腔，用 作注入电泳缓冲液。具体的操作方法如下(a) 电泳槽加入电泳缓冲液；(b) 取液孔下方的部分筒状主体的空腔加满电泳缓冲液，并盖紧取液孔胶 塞；(C)将核酸富集纯化装置浸入电泳槽内电泳缓冲液中；(d) 待纯化核酸与上样缓冲液(含指示染料)混匀后，加入到加样槽，并通 电；(e) 待指示染料条带全部进入取液孔下方缓冲液中，弃去取液孔下方的缓冲 液；(f) 重新注满电泳缓冲液于取液孔下方的空腔，盖紧取液孔胶塞，重新放入 电泳槽中，继续通电电泳，收集取液孔下方空腔的缓冲液进行酚氯仿抽提。本方法适用于初榨大豆油、菜籽油、玉米油，精练大豆油、菜籽油、玉米油、 多种调和油，以及花生油、芝麻油、橄榄油、棉籽油、棕榈油等食用油脂的适用 于PCR或相应下游实验的DNA的提取。以下将通过本具体地实施方式来对本专利技术 进行详细的描述。附图说明图1A大豆油内源基因检测电泳图谱；图1B菜籽油内源基因检测电泳图谱图1C玉米油内源基因检测电泳图谱图1D其余多种植物油内源基因检测电泳图谱；图1E其余多种植物油内源基因检测电泳图谱图2A初榨大豆油、精炼大豆油内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、 阴性参比、试剂空白)图2B初榨大豆油、精练大豆油抗除草剂基因实时荧光PCR检测图谱(含阳 性参比、阴性参比、试剂空白)图2C初搾大豆油、精练大豆油NOS终止子基因实时荧光PCR检测图谱(含 阳性参比、阴性参比、试剂空白)图2D初榨大豆油、精练大豆油35S启动子基因实时荧光PCR检测图谱(含 阳性参比、阴性参比、试剂空白)图2E初榨菜籽油、精练菜籽油内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)图2F初榨玉米油、精练玉米油内源基因实时荧光PCR检测图谱(含阳性参 比、阴性参比、试剂空白)图2G花生油、芝麻油、棉籽油、棕榈油、橄榄油植物内源基因实时荧光PCR 检测图谱(含阳性参比、阴性参比、试剂空白)图3如图所示为所述的长片段核酸富集纯化装置的结构示意图具体实施例方式1.试剂(全部试剂均为生物级别或优级纯级别) 1.1生物级别用水1.2 CTAB裂解液:3% CTAB (w/w), 1.4 mmol/L氯化钠，0.2 % (v/v)巯基乙醇，20咖ol/L EDTA， 100 mmol/L Tris-HC1， pH 8.0 1. 3 TE缓冲液(pH 8. 0):量取10 mL 1 mol/L Tris-Cl (pH8. 0)和2 mL 0. 5raol/L EDTA (pH 8.0),加水定容至1000 mL，分装后高压灭菌备用 1.4酚氯仿异戊醇(体积比25: 24: 1) 1.5异丙醇1.6 75%乙醇(v/v)1.7 LA溶液1.8 溴化乙锭lmg/ mL1.9 DNA:分子量标记物100 bp-2000 bp、 1000-20000bp 1.10琼脂糖1. 11 50XTAE缓冲液称取484 gTris，量取114. 2 mL冰乙酸，200 mL 0. 5 mol/L EDTA (pH8.0)，溶于蒸馏水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。使 用时，50倍稀释1.12 10X上样缓冲液:含0. 25%溴酚蓝(w/v)， 0. 25。/。二甲苯青FF (w/v)， 30%甘油(v/v)水溶液 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提取食用油脂中核酸的方法，按照以下步骤进行： （１）食用油脂中极性成分的萃取 采用水作为萃取剂分多次对食用油脂进行萃取，并用离心的方法进行油液分离； （２）萃取液的浓缩 全部转移萃取液于电热恒温干燥设备或其它干燥设备内，充分干燥； （３）食用油脂中ＤＮＡ的粗提； （４）粗提ＤＮＡ的纯化。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李丹宁，高东微，钟玉清，钟国强，何方洋，万宇平，
申请(专利权)人：广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，北京望尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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