牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其抑制剂和单抗及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学和医药领域，具体公开了牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其在制备检测或治疗牛传染性鼻气管炎的试剂或药物中的用途。本发明专利技术提供一种抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体，同时筛选出牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的抗原表位为

GD protein epitope polypeptide of bovine infectious rhintracheitis virus and its inhibitor and monoclonal antibody and its application

The invention belongs to the field of molecular biology and medicine, and discloses the bovine infectious nose tracheitis virus gD protein epitope polypeptide and its application in the preparation and detection or treatment of infectious bovine rhino tracheitis. The invention provides a monoclonal antibody against infectious bovine rhinotracheitis virus gD protein, and screening out the epitopes of gD protein of infectious bovine rhintracheitis virus.

【技术实现步骤摘要】
牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其抑制剂和单抗及其应用
本专利技术属于分子生物学和医药领域，具体地说，涉及牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其在制备检测或治疗牛传染性鼻气管炎的试剂或药物中的用途。
技术介绍
牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(InfectiousBovineRhinotracheitisvirus,IBRV)引起的一种重要的牛呼吸道疾病，可导致体重减轻、流产、产奶量下降、双侧结膜炎和极度不安等症状。临床上可分为呼吸道型、生殖道感染型、脑炎型、眼炎型和流产型。疾病的传播途径主要为直接接触病原体以及潜伏感染。该病具有较宽的宿主范围，限制了动物贸易，给养牛业的发展带来巨大经济损失。尽管此病病死率不高，但可能会继发细菌感染，并且该病毒可潜伏在神经节中，一旦激发便会向外界排毒，为疾病的控制带来很大困扰。IBRV是有囊膜的DNA病毒，全长135-140kbp，其基因组序列可分为约102-104kbp的独特长(UL)片段和约10.5-11kbp的独特短(US)片段，具有约24kbp的反向重复区。已经鉴定了73个编码蛋白的开放阅读框，其中10种具有编码糖蛋白的潜力。gD蛋白是存在于病毒囊膜中的抗原之一，由417个氨基酸组成，分子量约71Ku，GC含量为70％，去除N端的信号肽，产生成熟蛋白，共计399个氨基酸。gD蛋白能够刺激机体体液免疫和细胞免疫，并且是病毒复制的必须蛋白，与病毒吸附、侵入宿主细胞有关。研究证实gD蛋白能够比gC蛋白或者VP8衣壳蛋白产生更好的保护力。本专利技术采用gD蛋白作为研究对象，通过细胞融合制备其单克隆抗体，通过抗原表位的鉴定，加深对gD蛋白结构和功能的认识，为IBRV致病机理的研究及亚单位疫苗等新型疫苗的开发奠定基础。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是针对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白制备单克隆抗体并筛选识别IBRVgD单克隆抗体的表位及相应的抗原表位，为疾病的检测和治疗提供基础。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术通过大肠杆菌表达系统表达的IBRVgD-pET-28a重组蛋白为免疫原免疫BALB/c鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合。此外，本专利技术还利用原核重组gD蛋白作为包被抗原，经间接ELISA方法筛选得到一株稳定分泌抗gD蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Westernblot检测结果表明MAb2B6既与gD重组蛋白发生特异性反应(图1)，又可以与IBRV发生反应(图2)。同时，利用间接免疫荧光试验证明，MAb2B6可以与IBRV感染的MDBK细胞结合，荧光显微镜下可见特异性荧光(图3)。采用交互重叠多肽法对gD部分序列进行截短，与pGEX-6P-1连接构建重组质粒，经IPTG诱导表达，验证与MAb2B6的反应性，对与单抗反应的片段继续截短表达，直至筛选出与其反应的最短肽段。经过多次截短获得最短肽为7肽，即323GEPKPGP329。与其他分离株进行比对具有较高保守性，因此可特异性的检测IBRV。基于上述研究，本专利技术提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽，其包括氨基酸序列为323GEPKPGP329(如SEQIDNO.1所示)的片段。进一步地，氨基酸序列为323GEPKPGPSPDADRPE337(如SEQIDNO.2所示)的牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了一种与所述的蛋白抗原表位多肽结合的特异性抗IBRVgD蛋白单克隆抗体。需要说明的是，根据本领域常规技术手段制备的可分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，也属于本专利技术保护的范围。进一步地，本专利技术还提供了所述的抗原表位多肽在制备检测牛传染性鼻气管炎的试剂或试剂盒中的应用。例如，使用ELISA方法实现牛传染性鼻气管炎的检测。进一步地，本专利技术还提供了所述的单克隆抗体在制备治疗牛传染性鼻气管炎的药物中的应用。更进一步地，由于本专利技术发现了所述牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的抗原表位多肽，编码所述蛋白抗原表位多肽的核苷酸序列也应当属于本专利技术的保护范围，可利用其进行所述蛋白抗原表位多肽的表达等。本专利技术还提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽的小分子抑制剂，所述小分子抑制剂特异性针对所述蛋白抗原表位多肽，并结合所述蛋白抗原表位多肽并抑制其活性。更进一步地，本专利技术基于所鉴定的抗原表位多肽，提供一种亚单位疫苗，所述亚单位疫苗的肽段序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。所述抑制剂在制备治疗牛传染性鼻气管炎的药物中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体，同时筛选出牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的抗原表位。本专利技术以pET-28a为载体构建表达的蛋白作为免疫原免疫小鼠，筛选阳性杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体2B6与IBRVgD-pET-28a蛋白能够发生特异性反应。利用交互重叠多肽法筛选针对单克隆抗体2B6的抗原表位为7肽，即323GEPKPGP329，此抗原表位可特异性的检测牛传染性鼻气管炎。本专利技术为建立牛传染性鼻气管炎检测方法奠定基础。附图说明图1为本专利技术实施例2中MAb2B6的Westernblot图。图2为本专利技术实施例2中MAb2B6的Westernblot图；其中M为蛋白质分子质量标准；1为2B6与纯化的IBRV反应结果，2为2B6与未接毒SP2/0细胞裂解物反应情况。图3为本专利技术实施例2中MAb2B6的间接免疫荧光图。图4为本专利技术实施例3中表位初步截短的Westernblot图；其中M为蛋白质分子质量标准；1为pGEX-6P-11mMIPTG诱导；2为311-326-pGEX-6P-11mMIPTG诱导；3为316-330-pGEX-6P-11mMIPTG诱导；4为323-337-pGEX-6P-11mMIPTG诱导；5为326-340-pGEX-6P-11mMIPTG诱导。图5为本专利技术实施例3中表位精准确定的Westernblot图；其中M为蛋白质分子质量标准；1为323-327-pGEX-6P-11mMIPTG诱导；2为323-328-pGEX-6P-11mMIPTG诱导；3为323-329-pGEX-6P-11mMIPTG诱导；4为pGEX-6P-11mMIPTG诱导。图6为本专利技术实施例5中所设计的小分子药物对IBRV的抑制效应效果。图7为本专利技术实施例6中表位疫苗的抗体滴度。图8为本专利技术实施例7中7肽表位疫苗的抗体滴度。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1单克隆抗体的制备1、小鼠免疫小鼠免疫以切胶纯化的原核表达的重组gD-pET-28a蛋白免本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽，其特征在于，其包括氨基酸序列为

【技术特征摘要】
1.一种牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽，其特征在于，其包括氨基酸序列为323GEPKPGP329的片段。2.一种与权利要求1所述的蛋白抗原表位多肽结合的特异性抗IBRVgD蛋白单克隆抗体。3.分泌权利要求2所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。4.权利要求1所述的抗原表位多肽在制备检测牛传染性鼻气管炎的试剂或试剂盒中的应用。5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备治疗牛传染性鼻气管炎的药物中的应用。6.编码权利要求1所述蛋白抗原表位多肽的核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪宏波，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23