一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记与应用。与NtHMA4野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.1所示；与

Molecular markers and applications of a wild type and mutant of NtHMA4 gene for the identification of tobacco cadmium transport gene

The invention discloses a molecular marker and application of identifying the wild type and mutants of the cadmium transport gene NtHMA4 in tobacco. Markers associated with wild type NtHMA4 loci, the nucleotide sequence is shown as Seq No.1 and;

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记与应用。
技术介绍
镉(Cd)、砷(As)、铬(Cr)和汞(Hg)等是公认的对植物和人体危害比较大的重金属元素，其中镉对人体的伤害最大。烟草（Nicotianatabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物，而且烟草是富镉作物，其对镉的富集系数达到10，所以近年来关于降低烟草中的镉含量也逐渐成为烟草减害研究的一个热点。镉对人体的危害巨大，过量的镉进入人体内可能对血管造成损害；另外镉元素对肠道吸收铁具有抑制作用，还会干扰钴、铜、锌等微量元素的代谢过程，引起肺、肾、肝等人体脏器损害，最终可能导致致癌、致畸和致突变等作用。拟南芥中AtHMA2、AtHMA4主要负责锌和镉从根部向地上部的转运。过量表达HMA4基因可提高植株对镉的忍耐力及吸收力，而HMA4基因突变后则能增强植物对镉的敏感性。RNAi干涉NtHMA4基因的表达后可以降低地上部镉的镉含量（Hermand等，2014，Metallomics，6（8）：1427-1440）。为了降低烟草镉含量，利用EMS诱导我国大面积种植烟草品种云烟87，并从中筛选到一个NtHMA4基因突变体，命名为hma4-4h12。镉其镉含量可以降低到野生型的40%左右。突变体hma4-4h12可以应用于烟草育种培育低镉含量的烟草品种。开发一种简单、方便、有效的区分突变体与野生型品种的分子标记，以实现对突变型的精准鉴定，对后续利用突变位点进行育种筛选具有重要价值。专利技术内容本专利技术的第一目的在于提供一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记；第二目的在于提供所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的，与NtHMA4野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如SeqNo.1所示；与NtHMA4突变体位点检测相关的标记，其核苷酸序列如SeqNo.2所示。本发的第二目的是这样实现的，所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记在利用突变体利用突变体hma4-4h12改良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。本专利技术与现有的技术具有如下优点和效果：（1）开发了一种用于区分烟草镉转运基因NtHMA4突变体与野生型的分子标记，包括1对PCR扩增引物（HMA4-F5/HMA4-R5）和1个限制性内切酶AIwNI。（2）本专利技术的功能性标记通过常规PCR扩增和酶切反应，能够特异性地检测NtHMA4基因突变后的低镉突变体hma4-4h12，而不需要通过测序检测突变等位基因。本标记更加简单、快捷。该标记可以应用于利低镉突变体hma4-4h12培育低镉烟草材料的过程中，尤其是回交改良低镉特性时，每个回交世代都要选择杂合基因型，该标记可以准确选择目标基因型（杂合型）与轮回亲本回交。附图说明图1为烟草镉转运基因NtHMA4野生型序列与突变体hma4-4h12序列比对结果；图2为PCR引物HMA4-F5/HMA4-R5扩增产物电泳图，其中：M为100bpDNALadder，1-4：突变位点为突变纯合材料，5-9：突变位点为杂合材料，10-15：突变位点为野生型纯合材料；图3为PCR产物经AIwNI酶切后电泳图，其中M：100bpDNALadder，1-4：突变位点为突变纯合材料，5-9：突变位点为杂合材料，10-15：突变位点为野生型纯合材料；图4为样品测序结果，方框所示为突变碱基位点，上为样品1：突变位点为碱基T，显示单峰，突变体纯合；中为样品5：突变位点为碱基T和C混合，显示双峰，杂合突变；下为样品10：突变位点为碱基C，显示单峰，野生型纯合。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记，与NtHMA4野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如SeqNo.1所示；与NtHMA4突变体位点检测相关的标记，其核苷酸序列如SeqNo.2所示。NtHMA4突变体为hma4-4h12突变体。本专利技术所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的引物对，所述的引物对为：上游引物：HMA4-F5：TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAG；下游引物：HMA4-R5：TCATGAATAACAATGACAGTCTCT。本专利技术所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的应用为所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记在利用突变体利用突变体hma4-4h12改良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。本专利技术所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的鉴定方法，包括以下步骤：（1）利用PCR引物HMA4-F5/HMA4-R5对烟草基因组进行PCR扩增；（2）PCR产物经纯化后利用AIwNI酶切，如果PCR产物能被AIwNI酶切，则为野生型；如果PCR产物不能被AIwNI酶切，则为突变体。步骤（1）所述的PCR扩增利用ExTaq进行（Takara），25µL体系，PCR体系包括以下成分：ExTaq0.125µL10xExTaqBuffer(Mg2+free)2.5µLMgCl22µLdNTP(2.5mM)2µL基因组DNA0.5µL上游引物HMA4-F5（10µM）0.5µL下游引物HMA4-R5（10µM）0.5µL灭菌超纯水16.875µL。步骤（1）所述的PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，35个循环；72℃7min。本专利技术所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记，与NtHMA4野生型位点检测相关的核苷酸序列如下所示（SeqNo.1）：TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAGAATGGTGGAAAGTGAGAAAATGAATGACACAAAGAATCTGAGCAAGAGCTATTTTGATGTTTTGGGAATTTGCTGTACTTCAGAAGTTGTTCTTGTTGAAAAAATTCTCAAGAATCTTGAAGGGGTTAAAGAGGTTTCAGTAATTGTCACAACAAAGACTGTCATTGTTATTCATGA与NtHMA2突变体位点检测相关的核苷酸序列如下所示（SeqNo.2）：TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAGAATGGTGGAAAGTGAGAAAATGAATGACACAAAGAATCTGAGCAAGAGCTATTTTGATGTTTTGGGAATTTGCTGTACTTCAGAAGTTGTTCTTGTTGAAAAAATTCTCAAGAATCTTGAAGGGGTTAAAGAGGTTTCAGTAATTGTCACAATAAAGACTGTCATTGTTATTCATGA所述的镉转运基因突变体为hma4-4h12。本专利技术还公开了一种用于鉴别上述烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变型的分子标记引物，具体为：上游引物：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记，其特征在于与NtHMA4野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.1所示；与

【技术特征摘要】
1.一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记，其特征在于与NtHMA4野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如SeqNo.1所示；与NtHMA4突变体位点检测相关的标记，其核苷酸序列如SeqNo.2所示。2.根据权利要求1所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记，其特征在于NtHMA4突变体为hma4-4h12突变体。3.一种权利要求1或2所述鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的引物对，其特征在于所述的引物对为：上游引物：HMA4-F5：TAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAG；下游引物：HMA4-R5：TCATGAATAACAATGACAGTCTCT。4.一种权利要求1或2所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记的应用，其特征在于所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分子标记在利用突变体利用突变体hma4-4h12改良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。5.一种权利要求1或2所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA4野生型和突变体的分...

【专利技术属性】
技术研发人员：高玉龙，李文正，王丙武，宋中邦，李梅云，焦芳婵，吴玉萍，李永平，徐向丽，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南,53