用于同时检测蓝莓四种病害病原菌的核酸、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及用于同时检测蓝莓四种病害病原菌的核酸、试剂盒及方法，核酸包括用于检测枝枯病病原菌的上、下游引物，检测溃疡病病原菌的上、下游引物，检测叶斑病病原菌的上、下游引物和检测根癌病病原菌的上、下游引物。试剂盒中包括对应各病原菌的特异性引物和探针。本发明专利技术提供的试剂盒使用方便，所用的试剂少，检测的特异性强，灵敏度高。还提供了对导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的检测方法，该方法实现了对同一个样本，可进行4种病原菌的检测，大大简化了操作过程，减少了重复操作的过程，节省时间，减轻重复操作消耗的劳动力，并有效节约成本，实现快速筛查。

Nucleic acid, kit and method for simultaneous detection of four disease pathogens of Blueberry

The invention relates to a method for simultaneous detection of nucleic acid, reagent kit and method of four kinds of blueberry pathogens, including nucleic acid bacteria for shoot blight pathogen detection of the upstream and downstream primers, canker pathogen detection, downstream primer, pathogen of leaf spot disease detection and downstream primers and detection of pathogenic bacteria on root cancer the downstream primer. The kit includes specific primers and probes corresponding to the pathogenic bacteria. The kit provided by the invention has the advantages of convenient use, few reagents, strong specificity and high sensitivity. The result also provides a detection method of blueberry shoot blight and canker disease, leaf spot and root knot of four species of pathogenic bacteria, the method is realized on the same sample, can detect 4 kinds of pathogens, greatly simplifies the operation process, reduce the repeated operation process, save time, reduce repeated operation the consumption of labor, and save cost effectively, achieve rapid screening.

【技术实现步骤摘要】
用于同时检测蓝莓四种病害病原菌的核酸、试剂盒及方法
本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种用于同时检测蓝莓四种病害病原菌的试剂盒及方法。
技术介绍
蓝莓(Vacciniumspp.)，是一类属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)的多年生小浆果类果树，广泛地应用于医药、保健、化妆品和环境保护等各方面，联合国粮农组织将其果实列为人类世界五大健康食品之一，也是我国南方酸性土丘陵地区值得发展的经济作物。全国已超过10个省份开始大面积的蓝莓商业化栽培，预计未来10年将超过10万hm2。但是，随着生产面积的不断扩大，蓝莓病害也日趋严重，严重影响和制约蓝莓产业的发展。蓝莓病害有蓝莓枝枯病即枝条枯萎病，表现枝枯和茎枯病症状主要为害嫩枝、枝条和主干，发病初期，感病枝条上产生红褐色圆或椭圆形坏死斑，随后逐渐扩大，造成枝条干枯死亡，并可扩展造成主干枯萎。调查发现，该病发病率通常在10％～20％，重者可达25％以上，可引起蓝莓整株枯萎死亡。蓝莓溃疡病在发病早期，部分枝条任呈现健康症状，但是发病枝条的韧皮部或木质部的横切面显示病变，颜色呈现淡褐色或灰黑色，典型症状表现为枝条或茎秆的枯萎死亡。蓝莓叶斑病是一种普遍性病害，在蓝莓的一生中均可发生，主要危害叶片，感染初期在叶片上出现斑点，斑点逐渐扩大形成病斑，影响叶片的光合作用，从而阻碍果树的生长、发育及坐果情况。蓝莓根癌病的病害症状，早期表现为根部出现小的隆起，表面粗糙的白色或肉色瘤状物，之后颜色慢慢变深、增大，最后变成棕色或黑色。直接影响植株根部吸收，造成植株营养不良，发育受阻。有研究通过对病害植株根系的分离获得了19株致病菌，并确定是由根癌土壤杆菌侵染导致蓝莓根癌病的发生。但是目前对根癌土壤杆菌未见有报道。近年来，蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病在我国蓝莓产区的发病率不断上升，四者复合侵染的情况越来越多，每年给我国蓝莓产业造成逾百亿元的经济损失。目前尚缺乏蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的高效杀菌剂和抗病品种，一旦发现有感染这四种病害，需要及时清除病树，防止病害蔓延此外，还要加强非疫区的管理，防止这几种病害的侵入，因此，针对导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病和叶斑病的病原菌，建立早期快速检测方法就显得尤为重要。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题为了解决现有技术的上述问题，本专利技术提供一组用于同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的四种病原菌的核酸。本专利技术还提供一组用于荧光定量PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的四种病原菌的试剂盒及其检测方法。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：一组用于多重PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的核酸，包括检测枝枯病病原菌的上、下游引物，检测溃疡病病原菌的上、下游引物，检测叶斑病病原菌的上、下游引物和检测根癌病病原菌的上、下游引物；其中，所述枝枯病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物序列如SEQIDNo.2所示；所述溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.4所示，下游引物序列如SEQIDNo.5所示；所述叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示；所述根癌病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.10所示，下游引物序列如SEQIDNo.11所示。一组用于荧光定量PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的核酸，包括枝枯病病原菌的上、下游引物和探针、溃疡病病原菌的上、下游引物和探针、叶斑病病原菌的上、下游引物和探针、及根癌病病原菌的上、下游引物和探针；所述枝枯病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示；所述溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.4所示，下游引物序列如SEQIDNo.5所示，探针序列如SEQIDNo.6所示；所述叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示，探针序列如SEQIDNo.9所示；所述根癌病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.10所示，下游引物序列如SEQIDNo.11所示，探针序列如SEQIDNo.12所示。如上所述的核酸，优选地，还包括检测枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的阳性扩增产物，其中，所述检测枝枯病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.13所示的序列；所述检测溃疡病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.14所示的序列；所述检测叶斑病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.15所示的序列；所述检测根癌病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.16所示的序列。一种用于同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的病原菌的试剂盒，该试剂盒包括：检测上述枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌、根癌病病原菌的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5′端和3′端分别对应标记JOE-TAMRA、Texred-MGB、FAM-BHQ1和CY5-BHQ3。如上所述的试剂盒，优选地，还包括2×PremixEXTaq，和/或枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的阳性扩增产物。一种用于荧光定量PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的方法，包括以下步骤：(1)从样品中提取DNA；(2)对所述步骤(1)提取的DNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，采用枝枯病病原菌的上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，其5′端和3′端分别对应标记JOE和TAMRA；溃疡病病原菌的上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示，探针的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，其5′端和3′端分别对应标记Texred和MGB；叶斑病病原菌上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示，探针的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示，其5′端和3′端分别对应标记FAM和BHQ1；根癌病病原菌上、下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.10和SEQIDNo.11所示，探针的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，其5′端和3′端分别对应标记CY5和BHQ3；(3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。如上所述的方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：1×PremixEXTaq所述枝枯病病原菌的上游引物的终浓度为60nmol/L，下游引物的终浓度为60nmol/L，探针的终浓度为80nmol/L；所述溃疡病病原菌的上游引物的终浓度为200nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L，探针的终浓度为100nmol/L；所述叶斑病病原菌的上游引物终浓度为80nmol/L，下游引物终浓度为80nmo本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于多重PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的核酸，其特征在于，其包括检测枝枯病病原菌的上、下游引物，检测溃疡病病原菌的上、下游引物，检测叶斑病病原菌的上、下游引物和检测根癌病病原菌的上、下游引物；其中，所述枝枯病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；所述溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示；所述叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示；所述根癌病病原菌的上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ ID No.11所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于多重PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的核酸，其特征在于，其包括检测枝枯病病原菌的上、下游引物，检测溃疡病病原菌的上、下游引物，检测叶斑病病原菌的上、下游引物和检测根癌病病原菌的上、下游引物；其中，所述枝枯病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物序列如SEQIDNo.2所示；所述溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.4所示，下游引物序列如SEQIDNo.5所示；所述叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示；所述根癌病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.10所示，下游引物序列如SEQIDNo.11所示。2.一组用于荧光定量PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的核酸，其特征在于，其包括枝枯病病原菌的上、下游引物和探针、溃疡病病原菌的上、下游引物和探针、叶斑病病原菌的上、下游引物和探针、及根癌病病原菌的上、下游引物和探针；所述枝枯病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物序列如SEQIDNo.2所示，探针序列如SEQIDNo.3所示；所述溃疡病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.4所示，下游引物序列如SEQIDNo.5所示，探针序列如SEQIDNo.6所示；所述叶斑病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示，探针序列如SEQIDNo.9所示；所述根癌病病原菌的上游引物序列如SEQIDNo.10所示，下游引物序列如SEQIDNo.11所示，探针序列如SEQIDNo.12所示。3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，其还包括检测枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的阳性扩增产物，其中，所述检测枝枯病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.13所示的序列；所述检测溃疡病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.14所示的序列；所述检测叶斑病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.15所示的序列；所述检测根癌病病原菌的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.16所示的序列。4.一种用于同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病的病原菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：检测上述枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌、根癌病病原菌的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5′端和3′端分别对应标记JOE-TAMRA、Texred-MGB、FAM-BHQ1和CY5-BHQ3。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括2×PremixEXTaq，和/或枝枯病病原菌、溃疡病病原菌、叶斑病病原菌和根癌病病原菌的阳性扩增产物。6.一种用于荧光定量PCR同时检测导致蓝莓枝枯病、溃疡病、叶斑病和根癌病四种病原菌的方法，其特征在于，包括以下步...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，张翠萍，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37