同时检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病病原体的核酸、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一组用于同时检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的核酸、试剂盒和检测方法，其中，用于多重PCR同时检测三种病原体的核酸包括导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的上、下游引物；用于荧光定量PCR同时检测三种病原体的核酸还包括有各病原体对应的探针。本发明专利技术还建立了一种比较高效、灵敏的，可同时检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的病原体这三种病原的检测方法。该方法能有效提高检测的灵敏度，避免假阴性结果的发生，为能有效预防秋海棠会发生立枯病、斑点病和白粉病提供一种技术手段。

At the same time lead to detection of Begonia blight, leaf spot disease and powdery mildew pathogen nucleic acid, kit and method

The invention relates to a group for the simultaneous detection of three pathogens causing Begonia blight, powdery mildew and nucleic acid spots, kit and detection method, which, for the simultaneous detection of three pathogens including nucleic acid to three pathogens of Begonia blight, leaf spot disease and powdery mildew disease in the upstream and downstream primers for multiplex PCR; fluorescence quantitative PCR detection of nucleic acids and three kinds of pathogens including the corresponding pathogen. The present invention also established an effective and sensitive detection method, can simultaneously detect the cause of Begonia spot blight, powdery mildew and pathogens of the three pathogens. This method can effectively improve the detection sensitivity, to avoid false negative results, for the effective prevention of Begonia occur blight, providing a means scab and powdery mildew.

【技术实现步骤摘要】
同时检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病病原体的核酸、试剂盒及方法
本专利技术属于生物检测技术，具体涉及一种用于同时检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的病原体的核酸、试剂盒及方法。
技术介绍
秋海棠是中国的传统名花之一，该类群植物花朵鲜艳美丽，体态多姿，花期较长，易于栽培，长期以来作园艺和美化庭院的观赏植物。少数种类可供药用，秋海棠在我国园林绿化中起着重要的作用，近年来海棠立枯病、斑点病和白粉病的发病率不断上升，三者复合侵染的情况越来越多，每年给我国秋海棠种植的农户造成巨大损失。目前尚缺乏秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的高效杀菌剂和抗病品种，一旦发现有感染这三种病害，需要及时清除病树，防止病害蔓延此外，还要加强非疫区的管理，防止这三种病害的侵入，因此，针对秋海棠立枯病、斑点病和白粉病建立早期快速检测方法就显得尤为重要。秋海棠立枯病的症状是初近土面的茎基部染病生暗色斑点，扩展后变为棕褐色腐烂状；叶片染病生暗绿色水渍状圆形病斑，侵染叶柄时现褐色腐烂；湿度大的早晨可见病斑处长有白色至浅褐色茵丝状物；发病重的病株倒伏或腐烂死亡；其病原体为立枯丝核菌。秋海棠斑点病的症状是叶上初生水浸汰小斑点，逐渐扩大，成为大型不规则型的褐色病斑。叶片病斑沿叶脉扩展呈黑色水浸状，进而向茎部发展。茎部病斑为纵向细长干腐状，病斑绕茎一周，使受害处以上枯萎，以后受害部干枯、缢缩。其致病病原体为野油菜黄单胞菌秋海棠致病型细菌。秋海棠白粉病的症状是叶两面生白色斑片，边缘无定形，以后互相愈合无明显病斑，严重时叶哭死，植株早衰，球茎变小，影响次年生产；其主要病原体为秋海棠白粉菌。其菌丝体在叶两面生，花及叶柄生，以菌丝体和子囊果在病残体上越冬，次年气流传播，分生孢子或子囊孢子萌发后，芽管直接侵入，又多次再侵染。针对导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的检测方法，目前尚无能够快速、同时检测这三种病原体的方法。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于多重PCR同时检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的病原体的核酸，还提供了采用多重实时荧光定量PCR检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的病原体的核酸、试剂盒及其检测方法。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：一组用于多重PCR同时检测三种病原体的核酸，其包括用于检测分别导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的上、下游引物，其中，所述立枯病病原体的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物序列如SEQIDNo.2所示；所述斑点病病原体的上游引物序列如SEQIDNo.4所示，下游引物序列如SEQIDNo.5所示；所述白粉病病原体的上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示。一组用于荧光定量PCR同时检测三种病原体的核酸，其包括如上所述的分别导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的上、下游引物及各病原体对应的探针，其中，所述立枯病病原体的探针序列如SEQIDNo.3所示；所述斑点病病原体的探针序列如SEQIDNo.6所示；所述白粉病病原体的探针序列如SEQIDNo.9所示。如上所述的核酸，优选地，该组核酸还包括包含检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的阳性扩增产物序列，其中，所述检测立枯病病原体的阳性扩增产物序列，包含如SEQIDNo.10中第28-155bp之间所示的序列；所述检测斑点病病原体的阳性扩增产物序列，包含如SEQIDNo.11中第14-121bp之间所示的序列；所述检测白粉病病原体的阳性扩增产物序列，包含如SEQIDNo.12中第3-82bp之间所示的序列。一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原体的试剂盒，该试剂盒包括：如权利要求2所述的导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别对应标记TEXRED-BHQ1、FAM-TAMRA和CY5-BHQ3。如上所述的试剂盒，优选地，还包括检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的阳性扩增产物，其中，所述检测立枯病病原体的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.10中第28-155bp之间所示的序列；所述检测斑点病病原体的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.11中第14-121bp之间所示的序列；所述检测白粉病病原体的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.12中第3-82bp之间所示的序列。如上所述的试剂盒，优选地，还包括PremixEXTaqTM×2。一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原体的检测方法，该方法用于检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体，具体包括以下步骤：(1)从样品中提取DNA；(2)对提取的所述DNA进行荧光定量PCR扩增；其中，荧光定量PCR扩增时，在反应体系中，采用所述立枯病病原体的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，其探针5'端和3'端分别对应标记TEXRED和BHQ1；所述斑点病病原体的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示，其探针5'端和3'端分别对应标记FAM和TAMRA；所述白粉病病原体的上、下游引物和探针的核苷酸序列如SEQIDNo.7、SEQIDNo.8和SEQIDNo.9所示，其探针5'端和3'端分别对应标记CY5和BHQ3；(3)收集荧光信号，选择步骤(2)中的荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应体系具体如下：1×PremixEXTaqTM，所述立枯病病原体上游引物、下游引物的终浓度为0.24μmol/L，探针的终浓度为0.4μmol/L；所述斑点病病原体上游引物、下游引物的终浓度为0.24μmol/L，探针的终浓度为0.4μmol/L；所述白粉病病原体上游引物、下游引物终浓度为0.4μmol/L，探针的终浓度为0.64μmol/L；所述样品的DNA为1μL；同时设置无核酸酶水为阴性对照；同时分别设置包含如SEQIDNo.10所示的序列、SEQIDNo.11所示的序列、SEQIDNo.12所示的序列的基因作为阳性对照。如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(2)中荧光定量PCR扩增的反应程序为：预变性阶段95℃，5min；扩增阶段95℃，15sec；60℃，40sec；72℃，40sec，45个循环；72℃，7min；4℃保温。如上所述的检测方法，优选地，所述步骤(4)结果判定中，所述阈值为35，当Ct值≤35时，有明显扩增曲线为阳性结果；Ct值＞40时，无明显扩增曲线为阴性结果。(三)有益效果本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种用于普通PCR检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的核酸组，该组核酸可用于单一病原体的检测，也可用于这三种病原体同步检测的多重扩增使用。用于同步检测这三种病原体时，经过验证，相互之间不发生交叉反应，其检测灵敏度高，特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于多重PCR同时检测三种病原体的核酸，其特征在于，包括用于检测分别导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的上、下游引物，其中，所述立枯病病原体的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；所述斑点病病原体的上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示；所述白粉病病原体的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于多重PCR同时检测三种病原体的核酸，其特征在于，包括用于检测分别导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的上、下游引物，其中，所述立枯病病原体的上游引物序列如SEQIDNo.1所示，下游引物序列如SEQIDNo.2所示；所述斑点病病原体的上游引物序列如SEQIDNo.4所示，下游引物序列如SEQIDNo.5所示；所述白粉病病原体的上游引物序列如SEQIDNo.7所示，下游引物序列如SEQIDNo.8所示。2.一组用于荧光定量PCR同时检测三种病原体的核酸，其特征在于，包括如权利要求1所述的分别导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的上、下游引物及各病原体对应的探针，所述立枯病病原体的探针序列如SEQIDNo.3所示；所述斑点病病原体的探针序列如SEQIDNo.6所示；所述白粉病病原体的探针序列如SEQIDNo.9所示。3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，该组核酸还包括包含检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的阳性扩增产物序列，其中，所述检测立枯病病原体的阳性扩增产物序列，包含如SEQIDNo.10中第28-155bp之间所示的序列；所述检测斑点病病原体的阳性扩增产物序列，包含如SEQIDNo.11中第14-121bp之间所示的序列；所述检测白粉病病原体的阳性扩增产物序列，包含如SEQIDNo.12中第3-82bp之间所示的序列。4.一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原体的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：如权利要求2所述的导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别对应标记TEXRED-BHQ1、FAM-TAMRA和CY5-BHQ3。5.如权利要求4所述的试剂盒，优选地，还包括检测导致秋海棠立枯病、斑点病和白粉病的三种病原体的阳性扩增产物，其中，所述检测立枯病病原体的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.10中第28-155bp之间所示的序列；所述检测斑点病病原体的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.11中第14-121bp之间所示的序列；所述检测白粉病病原体的阳性扩增产物，含如SEQIDNo.12中第3-82bp之间所示的序列。6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括PremixEXTaqTM×2。7.一种用于荧光定量PCR同时检测三种病原体的检测方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，张翠萍，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37