源自枣树链霉菌属JL‑1、其活性物及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了源自枣树链霉菌属JL‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2017509；本发明专利技术还提供了链霉菌属JL‑1活性物以及该活性物的制备方法；本发明专利技术中的活性物能有效抑制细菌，且能用于制备抗菌药物和烯脂酰ACP还原酶抑制剂。

From Streptomyces JL jujube 1, the active material and preparation method and Application

The invention discloses a jujube from Streptomyces JL 1, preserved in Chinese type culture collection center, the preservation number is CCTCC No:M2017509; the invention also provides a preparation method of Streptomyces JL 1 active and the active substance; active material in the invention can effectively inhibit bacteria, and can be used for the preparation of antibacterial drugs and the enoyl reductase inhibitor ACP.

【技术实现步骤摘要】
源自枣树链霉菌属JL-1、其活性物及制备方法和应用
本专利技术属于农业微生物
，具体涉及源自枣树链霉菌属JL-1、其活性物及制备方法和应用。
技术介绍
由于一些细菌会对现有的抗生素产生耐药性，并且还存在令全球恐慌的超级耐药细菌，因而严重威胁人类的健康。自上世纪60年代以来，虽然科研工作者在长期的探索研究中努力寻找作用于新靶位点的新型抗生素，但是其研究成果依然是有限的。目前，尽管数以百计的细菌必需蛋白已经被鉴定可作为潜在药物作用靶点，但其中仅有少数细菌能作为临床治疗药物的靶点。研究者们通过对已有抗生素的骨架进行化学修饰来提高其活性，采用这种方法已经开发出了一些有效的抗生素。然而，通过化学修饰法却很难开发出更为有效的抗生素。为了适应临床医学的需要，尤其是克服细菌耐药性现象的出现，开发具有新的作用方式的抗生素化学骨架对于挽救生命是至关重要的。由于II型脂肪酸合成是细菌细胞生存的必需品，因而它是新抗生素的潜在靶点。细菌脂肪酸合成途径与哺乳动物的相比，虽然生化反应过程相似，但是二者在参与催化反应的酶结构和氨基酸序列上没有同源性，属不同的脂肪酸合成酶系。细菌和哺乳动物之间脂肪酸合成系统的显著差异以及脂肪酸在细胞中所扮演的特殊的角色，使该系统成为非常有吸引力的药物筛选靶点。脂肪酸合成途径中执行循环反应第四步的烯脂酰ACP还原酶是细菌脂肪酸合成所必需的，也是筛选抗菌药物的重要靶点。烯脂酰ACP还原酶催化Ⅱ型脂肪酸合成循环反应的最后一个限速步骤反-2-烯脂酰ACP的还原。在不同细菌中，已经发现了4种不同烯脂酰ACP还原酶，FabI、FabL、FabK和FabV，如表1所示。表1细菌烯脂酰ACP还原酶的多样性种类辅因子活性中心序列SDRs三氯生作用分布FabINAD(P)HTyr-(Xaa)6-Lys是敏感大多数细菌FabLNADPHTyr-(Xaa)6-Lys是不敏感枯草芽孢杆菌FabKNADHFMN结合序列否不敏感肺炎链球菌、粪肠球菌等FabVNADHTyr-(Xaa)8-Lys是不敏感霍乱弧菌、绿脓杆菌等注：SDRs为短碳链醇脱氢酶/还原酶超家族成员。烯脂酰ACP还原酶已被证明是在市场上销售的抗菌剂三氯生(triclosan)和异烟肼(isoniazid)的作用靶点。虽然烯脂酰ACP还原酶的许多其它抑制剂已经被报道，但是到目前为止市场上还没有出现以烯脂酰ACP还原酶为药物靶点的新的已商品化的抗菌剂。目前，从微生物中已经发现了22500种生物活性物质，其中70％的物种都是由放线菌产生。放线菌是抗生素的主要来源，且60％的抗生素都是由放线菌产生，其中主要为链霉菌属，如链霉素、金霉素、四环素、巴龙霉素、丝裂霉素等重要抗生素。链霉菌一直被认为是产生各种抗生素的主要来源。根据遗传多样性分析表明，链霉菌属能产生上万种抗生素，但是，目前已经发现的抗生素种类比较少。随着微生物功能基因组学的深入研究，越来越多的新型药物靶点将被鉴定并建立相应药物筛选模型，因此，将会发现更多的产自链霉菌属的抗生素。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供源自枣树链霉菌属JL-1，用于分离抗生素。本专利技术的第二目的是提供该链霉菌属JL-1活性物。本专利技术的第三目的在于提供上述链霉菌属JL-1活性物的制备方法。本专利技术的第四目的是提供该活性物在抗菌药物和烯脂酰ACP还原酶抑制剂中的应用。本专利技术所采用的第一种技术方案是，源自枣树链霉菌属JL-1保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCCNo：M2017509，保藏日期：2017.9.14。本专利技术所采用的第二种技术方案是，该链霉菌属(Streptomycessp.)JL-1活性物的制备方法，具体包括以下步骤：步骤1，种子液的制备；将链霉菌属(Streptomycessp.)JL-1菌株接入种子培养基中，在25℃～30℃、150r/min～210r/min振荡条件下培养3d～4d，得到种子液；步骤2，发酵培养；将步骤1得到的种子液接入发酵培养基中，接种量为5％～10％，在25℃～30℃、150r/min～210r/min振荡条件下培养20d～25d，得到发酵液；步骤3，活性物的制备；步骤3.1、将步骤2中得到的发酵液超声破碎后，过滤除去菌体，用乙酸乙酯萃取发酵滤液，浓缩挥干后，得到浸膏A；步骤3.2、将步骤3.1中过滤除去的菌体进行冷冻干燥，之后放入甲醇溶液中浸泡、过滤后除去菌体，将滤液浓缩挥干后，加入水溶液，用乙酸乙酯萃取滤液，浓缩挥干后，得到浸膏B；步骤3.3、将步骤3.1中的浸膏A和步骤3.2中的浸膏B混合，即为活性物。本专利技术第二种技术方案的特点还在于，步骤1中，种子培养基由以下重量配比的物质组成：可溶性淀粉20g/L～40g/L，硝酸钾1.0g/L～1.5g/L，氯化钠0.5g/L～1.0g/L，七水硫酸镁0.5g/L～1.0g/L，三水磷酸氢二钾0.5g/L～1.0g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L～0.05g/L，pH为7.1～7.3，溶剂为水。步骤2中，发酵培养基由以下重量配比的物质组成：碳源2.5g/L～5.0g/L，丙酮酸钠2g/L～4g/L，硝酸钾0.25g/L～1g/L，脯氨酸1g/L～2g/L，七水硫酸镁0.2g/L～0.4g/L，三水磷酸氢二钾0.2g/L～0.4g/L，无水氯化钙0.5g/L～1.0g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L～0.05g/L，pH为7.1～7.3，溶剂为水；步骤2中，碳源为燕麦粉、黄豆饼粉、大米粉或纤维素中的任意一种。本专利技术所采用的第三种技术方案是，该活性物在抗菌药物和烯脂酰ACP还原酶抑制剂中的应用。本专利技术的有益效果是：提供了一株作用靶标为烯脂酰ACP还原酶FabI的具有抗细菌作用的放线菌，还提供了利用该菌株发酵生产抗菌活性物质的方法，为新药研发奠定了基础。附图说明图1是本专利技术链霉菌属JL-1在高氏I号固体培养基上的菌落照片；图2是本专利技术链霉菌属JL-1在胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)固体培养基上的菌落照片；图3是本专利技术链霉菌属JL-1活性物抑制细菌FabI效果图。图中，1.携带空质粒pHSG575的大肠杆菌野生菌MG1655，2.携带重组质粒pHSG575-SpfabK的大肠杆菌野生菌MG1655(该菌异源表达肺炎链球菌的fabK)，3.大肠杆菌野生菌MG1655(pHSG575-SpfabK)，并在平板中添加3μg/mL的三氯生抗菌剂，4.携带重组质粒pHSG575-PafabV的大肠杆菌野生菌MG1655(该菌异源表达铜绿假单胞菌的fabV)，5.大肠杆菌野生菌MG1655(pHSG575-PafabV)，并在平板中添加3μg/mL的三氯生抗菌剂，6.铜绿假单胞菌野生菌PAO1，7.敲除铜绿假单胞菌野生菌PAO1的fabI基因的突变株PAO-I，8.敲除铜绿假单胞菌野生菌PAO1的fabV基因的突变株PAO-V。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1本专利技术源自枣树链霉菌属JL-1的筛选分离过程为：链霉菌属(Streptomycessp.)JL-1是从陕北地区的枣树中分离得到；将采集到的枣树枝条在120℃下加热1h后，剪碎，接种在含有775μg/mL重铬酸钾和2μg/mL青霉素的1本文档来自技高网...

【技术保护点】
源自枣树链霉菌属JL‑1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2017509。

【技术特征摘要】
1.源自枣树链霉菌属JL-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2017509。2.一种活性物，其特征在于，该活性物是在权利要求1所述的链霉菌属JL-1中提取。3.一种如权利要求2所述的活性物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1，种子液的制备；将链霉菌属JL-1菌株接入种子培养基中，在25℃～30℃、150r/min～210r/min振荡条件下培养3d～4d，得到种子液；步骤2，发酵培养：将步骤1得到的种子液接入发酵培养基中，接种量为5％～10％，在25℃～30℃、150r/min～210r/min振荡条件下培养20d～25d，得到发酵液；步骤3，活性物的制备；步骤3.1、将步骤2中得到的发酵液超声破碎后，过滤除去菌体，用乙酸乙酯萃取发酵滤液，浓缩挥干后，得到浸膏A；步骤3.2、将步骤3.1中过滤除去的菌体进行冷冻干燥，之后放入甲醇溶液中浸泡、过滤后除去菌体，将滤液浓缩挥干后，加入水溶液，用乙酸乙酯萃取滤液，浓缩挥干后，得到浸膏B；步骤3.3、将步骤3.1中的浸膏A和步骤3.2中的浸膏B混合，即为活性物。4.根据权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：林金水，成娟丽，张向前，王延峰，贺晓龙，王贵锋，田野，张恒，
申请(专利权)人：延安大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61