一种人食管癌细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人食管癌细胞系及其应用。该人食管癌细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201661。该人食管癌细胞系在保留主要临床生物学特征的前提下，具有成瘤率高，潜伏期短，均一性好等特点，丰富了人食管癌细胞库，为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料，也为新药临床前研究体内体外实验提供新的试验材料。

A human esophageal carcinoma cell line and its application

The present invention discloses a human esophageal cancer cell line and its application. The preservation of human esophageal cancer cell culture collection in Chinese typical, the preservation number is CCTCC NO:C201661. The human esophageal cancer cell lines while retaining the main clinical and biological features, with a high rate of tumor formation, short latency, features good homogeneity, enrich the human esophageal cancer cell library, provides scientific data for the study of Chinese population genetic background on the basis, also provide new experimental materials in vivo and in vitro studies the experiment for the preclinical.

【技术实现步骤摘要】
一种人食管癌细胞系及其应用
本专利技术属于细胞系领域，特别涉及一种人食管癌细胞系及其应用。
技术介绍
食管癌是指从下咽部至食管胃结合之间食管上皮来源的恶性肿瘤。食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，但发病水平高低相差悬殊，有明显的地域特征性。我国尤其是食管癌的高发国家，其发病率和死亡率均居世界之冠。据统计，全世界每年大约有20余万人死于食管癌，其中我国每年死于食管癌者约15万人，占全世界的四分之三。在我国，食管癌中95％以上是鳞状细胞癌，少数为起源于食管腺体或异位胃粘膜的腺癌，偶见有腺鳞癌或腺棘癌。食管癌早期症状常不明显，但在吞咽粗硬食物时可能有不同程度的不适感觉，包括咽下食物梗噎感，胸骨后烧灼样、针刺样或牵拉摩擦样疼痛。中晚期典型的症状为进行性咽下困难，先是难咽干的食物，继而是半流质食物，最后水和唾液也不能咽下。常吐黏液样痰，其为下咽的唾液和食管的分泌物。患者逐渐消瘦、脱水、无力。持续胸痛或背痛表示为晚期症状，癌已侵犯至食管外组织。因此，大多数病人确诊时已属中晚期，且由于肿瘤的大小、部位等影响，不能耐受手术切除，只能采用放化疗与手术治疗相结合的治疗手段。食管癌的治疗很长的一段时间内是以外科手术为标准的治疗手段，但由于术后较高的复发率，约有90％的患者复发转移。即使是分期很早的患者(T1)，仍有近50％的患者在5年内复发。因此，原发性食管癌病人总的预后不佳，迫切需要寻求更加有效的治疗方法。目前缺少用于食管癌发生机理及抗食管癌药物开发的接近临床肿瘤生物学特性的实验材料。而运用临床肿瘤组织直接建立细胞系的成功率较低，因此，通过运用临床肿瘤标本先建立动物模型，进而通过原代培养建立的人源肿瘤细胞具有更接近于肿瘤的临床生物学特性，对药物的耐药性及敏感性将具有更好的预测性，是研究食管癌发生分子机制和抗肿瘤药物筛选的理想实验材料。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题就是针对现有的人食管癌细胞系的生物多样性程度低、与临床上食管癌的生物学性状相差较大的不足，提供一种新的人食管癌细胞系及其应用。该人食管癌细胞系在保留主要临床生物学特征的前提下，具有成瘤率高等特点，丰富了人食管癌细胞库，为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料，也为新药临床前研究体内体外实验提供新的试验材料。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种人食管癌细胞系，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C201661。本专利技术还提供上述的人食管癌细胞系的子代细胞。本专利技术还提供上述的人食管癌细胞系的用途，其用于制备在非人类的哺乳动物中产生食管癌的试剂。本专利技术中，所述的非人类的哺乳动物为本领域常规的非人类的哺乳动物，较佳地为免疫缺陷小鼠，所述的免疫缺陷小鼠为本领域常规的免疫缺陷小鼠。较佳地为改造的免疫缺陷小鼠，如免疫功能重建的免疫缺陷小鼠。更佳地包括裸小鼠或SCID鼠。较佳地，所述的食管癌细胞系为鳞癌细胞系。本专利技术还提供一种上述人食管癌细胞系的建立方法，其包括以下的步骤，1)获得新鲜的临床食管癌手术切除标本，切成20～50mg的小块，皮下穿刺接种哺乳动物；2)穿刺接种70～90天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。其中，所述的哺乳动物、所述的食管癌都如上所述。本专利技术中，所述的新鲜的临床人食管癌切除标本较佳地用哺乳动物细胞培养液或生理盐水漂洗后再进行接种。更佳地用新鲜的HBSS缓冲液漂洗，所述HBSS缓冲液含有500U/mL青霉素G、500μg/mL硫酸链霉素和1.25μg/mL两性霉素B。本专利技术中，所述的原代培养方法可以是常规的哺乳动物细胞的原代培养方法。较佳地，其包括以下步骤：消化重悬肿瘤组织，过滤，纯化，得分散的细胞，将分散的细胞重悬于PC-1培养液，接种在培养瓶中，于37℃孵箱5％(v/v)CO2条件下静置培养至细胞长满培养瓶底80％以上。原代培养每3～4天换液一次。所述PC-1培养液为本领域常规的PC-1培养液，较佳地为购自Lonza公司的PC-1TM培养液。本专利技术中，所述的传代培养方法可以是常规哺乳动物细胞的传代培养方法。较佳地所述的传代培养方法包括以下步骤：吸弃进行原代培养的培养瓶中的培养液，向培养瓶中加入0.05％(w/w)胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，终止消化，向瓶内加入新鲜的PC-1培养液。当细胞传代到第十代以后，将培养液更换为RPMI1640培养液。所述RPMI-1640培养液包含10％(w/w)胎牛血清、10μg/mL青霉素G和2μM氢化可的松，所述百分比为质量百分比。本专利技术提供一种筛选治疗食管癌候选药物的体内实验方法，所述的体内实验方法包括以下步骤：将测试化合物施用于动物模型，施用后导致食管癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗食管癌的候选化合物，其中所述的动物模型具有如上所述的人食管癌细胞系所导致的食管癌肿瘤。较佳地，所述的体内实验方法包括以下的步骤：(1)将所述的食管癌细胞系或其子代细胞制备成细胞悬液，接种于哺乳动物皮下，进行饲养，获得人食管癌动物模型；(2)将测试化合物施用于动物模型，施用后导致食管癌症状改善或治愈的测试化合物就是治疗食管癌的候选化合物。本专利技术中，所述的动物模型为本领域常规的动物模型，较佳地为裸小鼠。所述的裸小鼠为本领域常规的裸小鼠，较佳地为Nu/Nu裸小鼠。建立动物模型的方法为本领域常规的方法。较佳地，可采用细胞悬液注射来建立动物模型。在施用步骤中，将测试化合物通过尾静脉注射、口服、腹腔注射或于肿瘤局部用药等方式施用于食管癌荷瘤动物。较佳地，所述方法还包括使用对照的步骤。所述对照为本领域常规的对照，较佳地，为不含测试化合物的溶剂施用于食管癌荷瘤动物。本专利技术还提供一种筛选治疗食管癌候选药物的体外实验方法，所述的体外实验方法包括以下步骤：将测试化合物以不同浓度直接施用于肿瘤细胞，根据对肿瘤细胞增殖的抑制效果，判断测试化合物对食管癌的抗肿瘤能力。具体的，本专利技术所述的体外实验方法包括以下步骤：(1)将所述的食管癌细胞或其子代细胞接种于96孔细胞培养板孔中，培养24小时；(2)将测试化合物稀释后施用于细胞，药物作用72小时后通过测定细胞的活力，通过化合物对细胞的增殖抑制能力，计算出化合物的半数抑制浓度，从而判断测试化合物的抗肿瘤能力。本专利技术中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本专利技术的有益效果如下：本专利技术的人食管癌细胞性状稳定，可稳定多次传代，为食管癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。具有成瘤性，可以成功制备食管癌动物模型，所制得的动物模型可以用于基础研究及药物筛选。通过与裸小鼠体内传代亲本肿瘤相比较，可用来分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性，进而可以建立体外、体内两个相关联的抗食管癌药物筛选平台。也可用于研究食管癌转移的发病机理、食管癌的耐药机理，进而可以寻找食管癌转移和耐药的特征生物标志物。是人食管癌基础研究和临床前期应用的理想细胞系。生物材料保藏信息本专利技术的人食管癌细胞系，于2016年4月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉武汉大学邮编430072，保藏编号为CCTCCNO：C2016本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人食管癌细胞，其特征在于，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201661。

【技术特征摘要】
1.一种人食管癌细胞，其特征在于，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C201661。2.如权利要求1所述的人食管癌细胞的子代细胞。3.如权利要求1或2所述的人食管癌细胞的用途，其特征在于，用于制备在非人类的哺乳动物中产生食管癌肿瘤的试剂。4.如权利要求3所述的人食管癌细胞的用途，其特征在于，所述的哺乳动物为免疫缺陷小鼠。5.如权利要求4所述的人食管癌细胞的用途，其特征在于，所述的免疫缺陷小鼠为免疫功能重建的免疫缺陷小鼠。6.如权利要求4所述的人食管癌细胞的用途，其特征在于，所述的免疫缺陷小鼠包括裸小鼠或SCID鼠。7.一种如权利要求1或2所述的人食管癌细胞的建立方法，其特征在于，包括以下步骤，1)获得新鲜的临床食管癌手术切除标本，切成20～50mg的小块，皮下穿刺接种哺乳动物；2)穿刺接种70～90天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。8.如权利要求7所述的方法，进行所述皮下穿刺接种前，所述的新鲜的临床人食管癌切除标本用HBSS缓冲液漂洗，所述的HBSS缓冲液包括500U/ml的青霉素G、500μg/ml的硫酸链霉素和1.25μg/ml的两...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐美青，郭明发，柳常青，戎保林，梅新宇，田界勇，葛晓梅，顾莹，谢付波，李利，孙丽丽，李富，周禾，
申请(专利权)人：安徽省立医院，上海睿智化学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34