本发明专利技术公开了一种与新型雌激素受体——G蛋白偶联雌激素受体(即：GPER)相结合的PDZ蛋白分子NHERF1及其相关应用，属于肿瘤生物治疗领域。在乳腺癌中，NHERF1通过与GPER相互作用，抑制GPER蛋白降解，促进GPER蛋白表达，进而调节GPER下游通路的激活，并且可以影响GPER亚细胞定位，从而参与调控乳腺癌发生、发展过程。本发明专利技术进一步为乳腺癌发病机制的研究、乳腺癌的诊断及预后提供新的思路，也为乳腺癌的治疗提供新的药物靶点。
Biological macromolecule NHERF1 and its application interacting with GPER
The invention discloses a PDZ protein molecule NHERF1 combined with a new estrogen receptor, G protein coupled estrogen receptor (GPER), and its related applications, which belongs to the field of tumor biotherapy. In breast cancer, NHERF1 interacts with GPER, inhibits GPER protein degradation, promotes GPER protein expression, further regulates GPER downstream pathway activation, and can affect GPER subcellular localization, thus participating in regulating the occurrence and development of breast cancer. The invention further provides new ideas for the study of breast cancer pathogenesis, diagnosis and prognosis of breast cancer, and also provides a new drug target for the treatment of breast cancer.
【技术实现步骤摘要】
与GPER相互作用的生物大分子NHERF1与应用
本专利技术属于肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种与新型雌激素受体GPER相互作用进而调节受体稳定性及亚细胞定位等生物学功能的PDZ蛋白分子NHERF1及相关应用。
技术介绍
乳腺癌是女性最常发的恶性肿瘤，约占女性所有肿瘤中的22％，其的发病率位居女性恶性肿瘤第一位，乳腺癌严重威胁女性身心健康。乳腺癌为雌激素依赖性的肿瘤，雌激素作为一种重要的甾醇类性激素，需要与雌激素受体结合，进而发挥生物学效应。经典的雌激素受体主要包括ERα和ERβ两种，雌激素与雌激素受体结合后，形成同源或异源二聚体进入细胞核，与雌激素应答元件结合，从而发挥调节靶基因表达的基因组效应；近年来研究发现，雌激素也可以发挥快速的信号转导过程，发挥非基因组效应，而这种效应是由一种新型雌激素受体介导的，即G蛋白偶联雌激素受体GPER。因此，GPER作为一种区别于经典ERs的雌激素受体，在介导雌激素非基因组效应、调节肿瘤发生发展中发挥重要作用。GPER广泛表达于乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中，临床研究显示，GPER蛋白表达水平和亚细胞定位与乳腺癌的发展及其预后显著相关，GPER过表达可能是导致乳腺癌恶性发展的重要因素，同时GPER的亚细胞定位可能是影响乳腺癌不良预后的因素之一。因此，深入探索乳腺癌中GPER蛋白水平和亚细胞定位的调节机制对于阐明乳腺癌的发生发展以及预后，进而展开分子靶向治疗具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够与新型雌激素受体GPER相互作用并能调控其生物学功能的生物大分子——NHERF1。本专利技术公开了一种生物大分子NHERF1，调节GPER稳定性及其亚细胞定位、下游通路等生物学功能，为展开乳腺癌分子靶向治疗提供依据。下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。附图说明图1是NHERF1与GPER在乳腺癌细胞系MCF-7中存在相互作用图图2是NHERF1能够促进GPER蛋白质稳定性图图3是NHERF1能够促进乳腺癌细胞内源GPER表达图图4是NHERF1表达水平与GPER下游靶基因激活呈正相关图图5是NHERF1能够影响GPER亚细胞定位图具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所诉是对本专利技术的解释而不是限定。GPER与乳腺癌的发生发展密切相关，被视为乳腺癌的一种新型标志物及潜在的治疗靶点。研究发现GPER在乳腺癌细胞、组织中高表达，其过表达可能导致GPER通路异常激活，进而促进乳腺癌的恶性发展；同时在临床研究中发现，GPER在细胞质膜高表达与不良预后密切相关。因此，本专利技术公开了生物大分子PDZ蛋白NHERF1可以调节GPER蛋白的表达水平和GPER的亚细胞定位。1、免疫共沉淀(Co-IP)检测NHERF1与GPER在乳腺癌细胞系中的相互作用培养乳腺癌MCF-7细胞，用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液收集细胞至1.5mL离心管，4℃旋转裂解30min。4℃、12000rpm条件下离心20min，小心收取上清，留取100μL作免疫印迹阳性对照，其余蛋白质裂解液中各加入10μlanti-GPER抗体，4℃旋转孵育过夜。4℃、3000rpm条件下离心1min，用WashBufferⅠ重悬洗涤沉淀4次(1ml/次)，再用1mLWashBufferⅡ洗涤沉淀1次，所得的沉淀物即为免疫共沉淀复合物。向免疫共沉淀复合物中加入蛋白质上样缓冲液，95℃加热5min使得沉淀复合物中的蛋白质互相分离，离心吸取上清，得到免疫印迹分析样品。将样品用Westernblot方法做进一步分析鉴定。将提取的蛋白以30～100μg的上样量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭1h后，分别与NHERF和GPER抗体孵育4℃孵育过夜，洗膜后室温下以对应的二抗孵育1h。洗膜后暗室X线胶片曝光，结果如图1。2、检测过表达/敲减NHERF1对GPER蛋白质降解的影响将稳定转染Flag-GPER的HEK-293细胞经胰酶消化后接种至6孔培养板中，使得次日细胞密度达到50％-60％。向细胞内分别瞬时转染GFP-Vector或GFP-NHERF1，转染表达质粒24h后，用不含抗生素的DMEM正常培养基稀释终浓度为20μg/ml的蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞不同时间，通过Westernblot检测两组样品中Flag-GPER降解情况，分析过表达NHERF1对Flag-GPER降解的影响。采用Image-J图像分析软件分析蛋白条带的灰度值，将目的蛋白与对照GAPDH的灰度值比值作为相对表达水平进行半定量分析。结果见图2A。将稳定转染Flag-GPER的HEK-293细胞经胰酶消化后接种至6孔培养板中，使得次日细胞密度达到50％-60％。向细胞内分别瞬时转染NHERF1-Scr或NHERF1-siRNA，转染干扰片段24h后，用不含抗生素的DMEM正常培养基稀释终浓度为20μg/ml的蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞不同时间，通过Westernblot方法检测两组样品中Flag-GPER降解情况，分析干扰NHERF1表达后对Flag-GPER降解的影响。采用Image-J图像分析软件分析蛋白条带的灰度值，将目的蛋白与对照GAPDH的灰度值比值作为相对表达水平进行半定量分析。结果见图2B。3、检测NHERF1对乳腺癌细胞内源GPER的表达水平调节在内源NHERF1高表达的MCF-7中转染NHERF1-shRNA，获得稳定干扰内源NHERF1表达的MCF-7细胞株(MCF-shNHERF1)，随后在该细胞株中通过瞬时过表达GFP-NHERF1的方法恢复NHERF1的表达水平，然后用Westernblot方法检测MCF-7细胞中内源GPER表达水平的变化。采用Image-J图像分析软件分析蛋白条带的灰度值，将目的蛋白与对照GAPDH的灰度值比值作为相对表达水平进行半定量分析。结果见图3。4、乳腺癌病人临床分析NHERF1表达水平与GPER下游靶基因激活情况为了明确NHERF1促进GPER蛋白质稳定性对于乳腺癌的临床意义，我们进一步对749例ER阳性浸润性乳腺癌和121例正常乳腺组织中NHERF1的mRNA水平表达情况进行了分析，与正常乳腺组织相比，NHERF1在乳腺癌组织中的表达水平显著升高。在乳腺癌细胞中NHERF1可促进GPER的稳定性而提高其表达水平，在乳腺癌患者细胞中NHERF1异常上调理论上应促进GPER蛋白的表达水平进而激活GPER的通路。为了验证这一假设，我们将乳腺癌患者标本根据NHERF1的表达水平的不同分为两组，将NHERF1mRNA表达值高于其中位数的样本定义为NHERF1高表达组(NHERF1High),将NHERF1mRNA表达值低于其中位数的样本定义为NHERF1低表达组(NHERF1Low)，然后对这两组患者人群进行GSEA分析，结果如图4所示：GPER下游的靶基因集明显的集中在NHERF1高表达组(FDR＝0.0060)，说明GPER下游通路的激活与NHERF1的表达水平呈显著的正相关。结果见图4。5、亚细胞结构分离实验检测NHERF1对GPER亚细胞定位的影响在内源NHERF1高表达的MCF-7中转染NHERF1-shRN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与新型雌激素受体GPER相关的生物大分子NHERF1，其特征在于NHERF1能够与GPER发生相互作用。
【技术特征摘要】
1.一种与新型雌激素受体GPER相关的生物大分子NHERF1，其特征在于NHERF1能够与GPER发生相互作用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于NHERF1又叫EBP50和SLC9A3R1。3.权利要求1所述的NHERF1通过与GPER相互作用，能够调节GPER的稳定性，下游通路...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺俊崎，熊英，秦琼，孟冉，王岩，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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