一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术揭露一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其包括两套引物探针，两套引物探针分别在LTR区、POL区的保守区域，所述两套引物探针序列分别为不同碱基数的上游引物、下游引物、探针。由于HIV基因组上两个待检的目的片段同时出现变异的几率非常低，从而降低了检测系统出现假阴性的几率。通过检测，两套引物探针同时发挥作用，与待检的目的片段结合并产生荧光，因此检测系统的灵敏度也相应提高。

A quantitative detection kit for human immunodeficiency virus nucleic acid

The invention discloses a human immunodeficiency virus nucleic acid quantitative detection kit, which comprises two sets of primers, two sets of primers respectively conservative region in the POL area and LTR area, the two sets of primers were probe sequence upstream primer and downstream primer and probe different alkali base. The probability of false negative in the detection system is reduced because of the very low probability of mutation at the same time in the two target fragments of the HIV genome. By testing, the two sets of primers probe at the same time to interact with the target fragments and produce fluorescence, so the sensitivity of the detection system is also improved.

【技术实现步骤摘要】
一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒
本专利技术属于核酸检测的分子诊断
，特别是涉及一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)属于反转录病毒科慢病毒属中的人类慢病毒组，是一种变异性很强的病毒，各基因的变异程度不同。HIV发生变异的主要原因包括反转录酶无校对功能导致的随机变异；宿主的免疫选择压力；病毒DNA与宿主DNA之间的基因重组；以及药物选择压力，其中不规范的抗病毒治疗是导致耐药性的重要原因。基因变异的结果直接可导致检测失败，造成假阴性的错误结果，或是定量不准确。本专利技术采用双靶检测，设计了两套用于检测HIV-1的引物探针，分别与不同的基因结合。由于HIV基因组上两个待检的目的片段同时出现变异的几率非常低，从而降低了检测系统出现假阴性的几率。艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征(Acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)，其病原体为人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus，HIV)，亦称艾滋病病毒。病毒载量一般用血浆中每毫升HIVRNA的拷贝数或每毫升国际单位(IU/mL)来表示。病毒载量测定的临床意义包括预测疾病进程、提供开始抗病毒治疗依据、评估治疗效果、指导治疗方案调整，也可作为HIV感染诊断的参考指标。测定病毒载量的常用方法有反转录PCR(RT-PCR)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)技术、分枝DNA信号放大系统(bDNA)和实时荧光定量PCR扩增技术(Real-timePCR)。其中实时荧光定量PCR扩增技术是较常用的方法。实时荧光定量PCR扩增技术的原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。一般使用TaqMan探针或SybrGreen荧光染料。但SybrGreen染料不能区别目的产物和非目的产物，使结果有偏差，目前广泛使用的是TaqMan探针技术。HIV有十分高的遗传变异率，它是一个多态性病毒，从不同的AIDS患者体内分离出的病毒结构表现出一定的差异，事实上，独立分离到的HIV-1和HIV-2彼此都不相同，这是由于病毒传播过程中突变、缺失或插入引起的，所以通常选择病毒基因组中高度保守区域作为目的基因进行扩增，才能有效地检测所有HIV。但是目前普通的实时荧光定量PCR扩增技术，仅采用一套引物探针较难扩增出所有的基因亚型，其后果是产生假阴性结果或各亚型间的定量不准确。专利申请号为第CN201310009032.3号中国专利技术专利揭露了一种人类免疫缺陷病毒HIV核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括至少两套引物探针，且所述至少两套引物探针分别来自不同的保守区域。所述保守区域包括HIV基因的相对保守区：GAG、POL和LTR区。本专利技术设计组合两个不同区域的两套引物探针配制反应体系对HIV-1RNA进行联合检测以鉴别阳性反应的存在，有效降低了漏检的几率，能够更全面的覆盖所有亚型(包括HIV-1的M、N、O群的所有亚型)，并进一步提高检测灵敏度和更准确地定量，其检测灵敏度可达50IU/ml，定量线性范围为50～1.0×108IU/ml。本专利技术另外提供一种HIV核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括一套引物探针序列，所述引物探针序列选自LTR1、LTR2、GAG1、GAG2、POL1和POL2这两套中的任意一套。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，以提高检测灵敏度和定量精准度。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其包括两套引物探针，两套引物探针分别在LTR区、POL区的保守区域，所述两套引物探针序列分别如下：LTR区：上游引物：5’-TTCGCCTGTACTGGGTCTCTCT-3’；下游引物：5’-CACTCAAGGCAAGCTTTATTG-3’；探针：5’-FAM-AGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-BHQ1-3’；POL区：上游引物：5’-TCAAAATTTTCGGGTTTATTACAG-3’；下游引物：5’-GCCCCTTCACCTTTCCA-3’；探针：5’-FAM-CAGAGACCCAATTTGGAAAGGACCAGC-BHQ1-3’。具体的，所述检测试剂盒还包括如下溶液：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。具体的，其溶液按照浓度比为0.05-0.4mmol/LdATP、0.05-0.4mmol/LdCTP、0.05-0.4mmol/LdGTP、0.05-0.4mmol/LdTTP、0.05-0.4umol/LLTR区上游引物、0.05-0.4umol/LLTR区下游引物、0.01-0.25umol/LLTR区探针、0.05-0.4umol/LPOL区上游引物、0.05-0.4umol/LPOL区下游引物、0.01-0.25umol/LPOL区探针的溶液混合。具体的，其溶液按照终浓度为0.2mmol/LdATP、0.2mmol/LdCTP、0.2mmol/LdGTP、0.2mmol/LdTTP0.2umol/LLTR区上游引物、0.2umol/LLTR区下游引物、0.05umol/LLTR区探针、0.2umol/LPOL区上游引物、0.2umol/LPOL区下游引物、0.05umol/LPOL区探针的溶液混合。相比现有技术，本专利技术人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒的有益效果在于：由于HIV基因组上两个待检的目的片段同时出现变异的几率非常低，从而降低了检测系统出现假阴性的几率。通过检测，两套引物探针同时发挥作用，与待检的目的片段结合并产生荧光，因此检测系统的灵敏度也相应提高。【具体实施方式】实施例一：本专利技术为一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其具有两套引物探针，其引物探针设计方法如下：下载NCBI、HIVdatabase公布的HIV-1序列，通过序列比对，在LTR区、POL区分别选取了保守区域，进行引物探针设计，两套引物探针序列分别如下：LTR区：上游引物02-F-27：5’-TTCGCCTGTACTGGGTCTCTCT-3’；下游引物02-R-26：5’-CACTCAAGGCAAGCTTTATTG-3’；探针02-P-12：5’-FAM-AGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-BHQ1-3’；POL区：上游引物02-F-11：5’-TCAAAATTTTCGGGTTTATTACAG-3’；下游引物02-R-10：5’-GCCCCTTCACCTTTCCA-3’；探针02-P-14：5’-FAM-CAGAGACCCAATTTGGAAAGGACCAGC-BHQ1-3’。以上设计了两套用于检测HIV-1的引物探针，分别与不同的基因结合。由于HIV基因组上两个待检的目的片段同时出现变异的几率非常低，从而降低了检测系统出现假阴性的几率。通过检测，两套引物探针同时发挥作用，与待检的目的片段结合并产生荧光，因此检测系统的灵敏度也相应提高。通过荧光定量PCR方法实时检测，改变了传统的电泳终点检测，得到相应的S型扩增曲线，其不但可以进行定性检测，更重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其包括两套引物探针，其特征在于：所述两套引物探针分别在LTR区、POL区的保守区域，所述两套引物探针序列分别如下：LTR区：上游引物：5’‑TTCGCCTGTACTGGGTCTCTCT‑3’；下游引物：5’‑CACTCAAGGCAAGCTTTATTG‑3’；探针：5’‑FAM‑AGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCT‑BHQ1‑3’；POL区：上游引物：5’‑TCAAAATTTTCGGGTTTATTACAG‑3’；下游引物：5’‑GCCCCTTCACCTTTCCA‑3’；探针：5’‑FAM‑CAGAGACCCAATTTGGAAAGGACCAGC‑BHQ1‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其包括两套引物探针，其特征在于：所述两套引物探针分别在LTR区、POL区的保守区域，所述两套引物探针序列分别如下：LTR区：上游引物：5’-TTCGCCTGTACTGGGTCTCTCT-3’；下游引物：5’-CACTCAAGGCAAGCTTTATTG-3’；探针：5’-FAM-AGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCT-BHQ1-3’；POL区：上游引物：5’-TCAAAATTTTCGGGTTTATTACAG-3’；下游引物：5’-GCCCCTTCACCTTTCCA-3’；探针：5’-FAM-CAGAGACCCAATTTGGAAAGGACCAGC-BHQ1-3’。2.如权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括如下溶液：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。3.如权利要求2所述的人类免疫缺陷病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于：其溶液按照浓度比为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂秋，黄翠华，另进华，
申请(专利权)人：李桂秋，
类型：发明
国别省市：广东,44