一种用于超声波辅助复合酶提取的榛蘑多糖的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种用于超声波辅助复合酶提取的榛蘑多糖的纯化方法，属于纯化多糖的制备领域。该纯化方法包括以下步骤：选择Sevage法脱蛋白，优化的工艺条件为样液与sevage试剂体积比5：1、氯仿与正丁醇体积比5：1、振摇时间30min,脱蛋白次数为三次；再用过氧化氢进行脱色，优化的工艺条件为脱色温度50℃、溶液pH值8.0、脱色时间3h，H2O2添加量为40％；利用乙醇分级沉淀获得两种组分的多糖Z1、Z2；最后利用SephadexG‑150凝胶层析柱进一步纯化，收集两种不同组分的榛蘑多糖洗脱液，经减压浓缩后，冻干处理后，得到纯净的两个多糖组分。

Purification method for ultrasonic assisted enzymatic extraction of mushroom polysaccharide

The invention discloses a purification method for ultrasonic assisted enzymatic extraction of polysaccharide of Armillaria mellea, belonging to the field of preparation and purification of polysaccharide. The purification method comprises the following steps: selecting Sevage method of removing protein, for liquid and Sevage reagent volume ratio 5:1, chloroform and n-butanol volume ratio 5:1, shaking time 30min optimization of process conditions, deproteinization times is three times; and hydrogen peroxide bleaching, bleaching temperature of 50 DEG C, the pH value of the solution 8, decolorization time 3H to optimize the process conditions, the amount of H2O2 is 40%; precipitation of polysaccharides Z1, Z2 two components using ethanol fractionation; finally the use of SephadexG further purified by gel chromatography column 150, collected two kinds of wild mushroom polysaccharide eluate was concentrated by vacuum freeze drying, after treatment two the pure polysaccharide group.

【技术实现步骤摘要】
一种用于超声波辅助复合酶提取的榛蘑多糖的纯化方法
本专利技术涉及了一种用于超声波辅助复合酶提取的榛蘑多糖的纯化方法，属于纯化多糖的制备领域。
技术介绍
榛蘑又可将其称作为蜜环菌，是一种既可作为药材又可作为营养食材的两用真菌。榛蘑不仅产量丰富，而且味道鲜美可口，是一种实至名归的“山珍”，在我国东北地区享有“东北第四宝”的美名。榛蘑中营养物质的含量是普通果蔬的十几倍，其中包括大量蛋白质、糖类、胡萝卜素、维生素等微量元素。榛蘑具有提高免疫力、降低胆固醇、降血压等功能。同时，视力衰退、皮肤干燥、夜盲等病症都可通过食用榛蘑以及相关的榛蘑制品得到有效的缓解。除此之外，经常食用榛蘑以及相关的榛蘑制品还可极大的增强人体对于某些呼吸道及消化道传染病的防御能力，因此可以大力开发具有多种功能性的榛蘑食品。榛蘑作为具有营养价值和保健疗效的药食两用天然产物，一定会给中国的食品行业带来巨大的经济利益，对其的探究和研发都是有价值的。榛蘑多糖提取可以采用热水、稀酸、稀碱作为浸提剂，也可采用超声波法辅助酶法提取。浸提法是提取榛蘑多糖的传统方法，但时间长、效率低、能耗大，此外在稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，因此多糖的提取率普遍不高。超声波辅助酶法提取多糖简单快捷、省时低耗，对榛蘑多糖的工业化提取及生产具有非常重要的现实意义。多糖是与人类生活息息相关的一类生物大分子。虽然多糖的来源各不相同，但是都要采用提取、分离和纯化等步骤，经过以上步骤处理后的多糖可以用来进一步研究多糖结构和活性。天然原料首先破碎后，经由粗提取得到水溶性的多糖组分，再经过脱蛋白、脱色、乙醇分级沉淀等步骤，得到粗多糖；经上述步骤得到的粗多糖再进一步纯化后，可以进行结构和活性的分析。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于超声波辅助复合酶提取的榛蘑多糖的纯化方法，采用的技术方案如下：本专利技术的目的是对提取的榛蘑多糖进行纯化，主要包括脱蛋白、脱色、乙醇分级沉淀几个步骤，具体方法步骤如下：通过前期实验，按照超声波辅助复合酶法提取榛蘑多糖的最优工艺进行多糖提取，即酶解温度50℃、超声功率360W、超声时间20min、加酶量1.9％、复合酶比例2：1、酶解时间138min、液料比30：1(mL/g)，将提取液冷却后离心，取将上清液减压浓缩，浓缩液即为粗多糖。对提出的粗多糖进行纯化处理，首先是除蛋白，选择Sevage法脱蛋白，通过改变氯仿-正丁醇体积比、样液-Sevage试剂体积比、脱蛋白次数、振摇时间等因素，研究不同因素对榛蘑多糖脱蛋白效果的影响，确定最佳提取工艺；其次是脱色，将过氧化氢加入到榛蘑多糖溶液中进行脱色，通过改变脱色温度、溶液pH值、脱色时间、过氧化氢添加量，研究不同因素对榛蘑多糖脱色效果的影响，确定最佳提取工艺。再利用乙醇分级沉淀的方法，将多糖溶液中乙醇的浓度先后调至40％、70％，经离心、冻干后得到两个组分的榛蘑多糖，将其命名为Z1、Z2；为了获得纯净的多糖组分，本试验利用SephadexG-150凝胶层析柱对经过乙醇分级沉淀所得到的2种组分进行进一步纯化，收集2种不同组分的榛蘑多糖洗脱液，经减压浓缩后，将这2种组分的多糖溶液进行冻干处理后备用。经过上述步骤，即得到纯净的多糖。附图说明图1蛋白质的标准曲线；图2样液-sevage试剂体积比对蛋白质和多糖含量的影响图3氯仿-正丁醇体积比对蛋白质和多糖含量的影响图4振摇时间对蛋白质和多糖含量的影响图5脱蛋白次数对蛋白质和多糖含量的影响；图6脱色温度对脱色率和多糖保留率的影响；图7溶液pH对脱色率和多糖保留率的影响；图8脱色时间对脱色率和多糖保留率的影响；图9H2O2添加量对脱色率和多糖保留率的影响；图10Z1(A)和Z2(B)组分的sephadexG-150凝胶柱层析洗脱曲线具体实施方式下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。一、Sevage法除蛋白1、蛋白质标准曲线的绘制分别以0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL体积的的牛血清蛋白液为梯度，用蒸馏水将其分别稀释至1mL。依次加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0mL，静置5min后，于波长595nm处测定OD值。以蒸馏水为空白对照。以标准牛血清蛋白含量为横坐标，OD值为纵坐标，绘制蛋白质标准曲线，计算出回归方程为图1。2、样液-Sevage试剂比例对榛蘑多糖脱蛋白效果的影响在氯仿与正丁醇体积比5：1、振摇时间30min、脱蛋白次数1次等条件下，研究不同样液与sevage试剂体积比对榛蘑多糖脱蛋白效果的影响，结果见图2。从图2中可以看出，随着样液-sevage试剂体积比的增大，蛋白脱除率和多糖保留率均显著增加。当样液-sevage试剂体积比达到5：1时，蛋白脱除率最大，为65.01％，同时多糖保留率为90.3％；当比例继续增大时，蛋白脱除率开始下降，虽然当样液-sevage试剂体积比为6：1时多糖保留率最大，为90.72％。但是方差分析结果表明，这两组数据差异性不显著，因此，考虑到两个指标对多糖脱蛋白效果的影响，本试验选用的最佳样液-sevage试剂体积比为5：1。3.氯仿-正丁醇比例对榛蘑多糖脱蛋白效果的影响在样液与sevage试剂体积比5：1、振摇时间30min、脱蛋白次数1次等条件下，研究不同氯仿与正丁醇体积比对榛蘑多糖脱蛋白效果的影响，结果见图3。从图3中可以看出，随着氯仿-正丁醇体积比的增大，蛋白脱除率在此期间随着体积比的增加而增大；同时多糖保留率也与体积比的增加成正比例增加趋势。当氯仿-正丁醇体积比达到5：1时，蛋白脱除率为70.02％，同时多糖保留率为90.57％；当比例继续增大为6：1时，蛋白脱除率和多糖保留率均稍有增加，分别为70.49％和90.86％，虽然当氯仿-正丁醇体积比为6：1时蛋白脱除率和多糖保留率最大，但是较氯仿-正丁醇体积比5：1时，蛋白脱除率和多糖保留率仅增加了0.47％和0.29％。方差分析结果表明，这两组数据差异性不显著，因此，考虑到两个指标对多糖脱蛋白效果的影响，本试验选用的最佳氯仿-正丁醇体积比为5：1。4、振摇时间对榛蘑多糖脱蛋白效果的影响在样液与sevage试剂体积比5：1、氯仿与正丁醇体积比5：1、脱蛋白次数1次等条件下，研究不同振摇时间对榛蘑多糖脱蛋白效果的影响，结果见图4。从图4中可以看出，随着振摇时间的增大，蛋白脱除率和多糖保留率都随着振摇时间的增加而增大。当振摇时间达到30min时，蛋白脱除率在此期间随着振摇时间的增加而增大，最大值为71.54％；同时多糖保留率也与振摇时间的增加成正比，为92.07％；当振摇时间继续增加，蛋白脱除率稍有下降，当振摇时间为50min时多糖保留率最大，为92.98％，此时的蛋白脱除率为71.48％，但是和振摇时间为30min相比，多糖保留率仅增大了0.91％。方差分析结果表明，这两组数据差异性不显著，因此，在同时考虑蛋白脱除率和多糖保留率的情况下，本试验选用的最佳振摇时间为30min。5、脱蛋白次数对榛蘑多糖脱蛋白效果的影响在样液与sevage试剂体积比5：1、氯仿与正丁醇本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于超声波辅助复合酶提取的榛蘑多糖的纯化方法，其特征在于所述方法步骤如下：步骤一：Sevage法除蛋白。设计4个单因素试验，分别是：样液与sevage试剂体积比(2：1、3：1、4：1、5：1、6：1)，氯仿与正丁醇体积比(2：1、3：1、4：1、5：1、6：1)，振摇时间(10、20、30、40、50min)，脱蛋白次数(3、4、5、6、7次)；步骤二：过氧化氢脱色。设计4个单因素试验，分别是：脱色温度(30、40、50、60、70℃)，溶液pH值(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，脱色时间(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h)，过氧化氢添加量(20、30、40、50、60％)；步骤三：采用乙醇分级沉淀的方法先后使多糖溶液中的乙醇浓度调至40％、70％，得到两个不同组分的榛蘑多糖；步骤四：使用SephadexG‑150凝胶柱层析法纯化两个组分的榛蘑多糖。

【技术特征摘要】
1.一种用于超声波辅助复合酶提取的榛蘑多糖的纯化方法，其特征在于所述方法步骤如下：步骤一：Sevage法除蛋白。设计4个单因素试验，分别是：样液与sevage试剂体积比(2：1、3：1、4：1、5：1、6：1)，氯仿与正丁醇体积比(2：1、3：1、4：1、5：1、6：1)，振摇时间(10、20、30、40、50min)，脱蛋白次数(3、4、5、6、7次)；步骤二：过氧化氢脱色。设计4个单因素试验，分别是：脱色温度(30、40、50、60、70℃)，溶液pH值(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，脱色时间(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h)，过氧化氢添加量(20、30、40、50、60％)；步骤三：采用乙醇分级沉淀的方法先后使多糖溶液中的乙醇浓度调至40％、70％，得到两个不同组分的榛蘑多糖；步骤四：使用SephadexG-150凝胶柱层析法纯化两个组分的榛蘑多糖。2.按...

【专利技术属性】
技术研发人员：于国萍，岳崇慧，陈媛，范美婧，藏小丹，刘鹏，董良伟，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23