一种城市饮用水水体遗传毒性的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种城市饮用水水体遗传毒性的检测方法，包括：采用反渗透技术对水样进行处理；对经过反渗透处理的浓缩水样进行固相萃取；分别进行Ames实验、重组大肠杆菌‑SOS效应和彗星实验，得出遗传毒性效应的当量浓度。本发明专利技术采用反渗透‑固相萃取‑成组遗传毒性实验测定水体遗传毒性的方法，可以对水体的遗传毒性进行综合的评价，解决了水体遗传毒性测定中前处理过程繁琐、有机试剂使用量大等难题。本方法操作便利、费时少、检测敏感性较高、操作危险性较低。

A method for detection of genotoxicity in urban drinking water body

The invention discloses a drinking water genetic toxicity City detection method, including: using reverse osmosis technology to process water; after water samples were concentrated with reverse osmosis treatment for solid-phase extraction; respectively Ames assay, recombinant Escherichia coli SOS effect and comet assay, the equivalent concentration that genetic toxicity. The invention adopts the method of determination of genotoxicity solid-phase extraction group genetic toxicity test of reverse osmosis, can make a comprehensive evaluation of the genotoxicity of water, solve the genotoxicity determination in the pretreatment process is tedious, the use of large amount of organic reagent problem. This method is easy to operate, Fei Shishao, sensitivity of detection is high, and operation risk is low.

【技术实现步骤摘要】
一种城市饮用水水体遗传毒性的检测方法
本专利技术涉及一种水体遗传毒性的测定方法，具体涉及一种城市饮用水水体遗传毒性的检测方法，属于检测分析领域。
技术介绍
水中大多数的痕量有机物本身具有长期残留性、生物积累性、半挥发性和高毒性等性质。这些有机物随人类活动大量地进入到环境当中，并沿着食物链浓缩放大，对人类的健康产生危害。虽然大部分有机物在水中的浓度非常低，但是大多数有机物难以降解，还有生物积累性，通过其在环境中的迁移、转化、富集，浓度水平可提高数倍甚至上百倍，对长期饮用者产生极大的潜在危害。有机污染物常以低浓度(10-6-10-9g/L甚至10-12g/L)多种类存在于水中，要对其进行化学测定和毒理学试验，必须先进行分离和浓缩。常用的富集方法有液液萃取、膜渗透、冷冻、吸附浓缩、顶空分析和吹扫捕集等方法，在实验中常根据实验的对象和实验性质，选择合适的分离富集方式。饮用水中有机化学物质种类繁多、浓度较低，这要求分析方法的灵敏度与精确度很高，且有机有害物质的毒理学效应为慢性作用，对人体的毒害多具有复合性；遗传毒性分析由于长期测试方法费时、对实验动物长期维护费用昂贵等缺点，被快速、便宜的短期筛选工具所取代，但由于各种快速检测方法的敏感性或阳性准确比例有高有低，至今未有一种检测方法的敏感度达100％，因此国内外推荐几种短期试验联用，即组合试验(batterytest)，并兼顾不同的细胞类型(原核细胞和真核细胞)和不同的观察终点(基因突变和染色体畸变)(Bajpayeeetal.,2005)进行生物综合毒性检测，来进行有效的饮用水安全评价。综合以上原因，研究一种简便高效、易操作的样品前处理方法，结合成组遗传毒性实验测定水体遗传毒性的方法势在必行。
技术实现思路
本专利技术针对上述水体遗传毒性测定方法的不足，提供了一种新型的测定水体遗传毒性的方法，即反渗透-固相萃取-成组遗传毒性实验方法。该方法通过对水样进行反渗透处理后，进行固相萃取，得到浓缩样品用于成组遗传毒性实验，从而能更为简便、稳定、灵敏的测定水体遗传毒性。在进行水中遗传毒性测定的试验中发现，样品前处理的方法存在操作繁琐、有机试剂使用量较大等缺点。本专利技术经创造性试验，发现先对水样进行反渗透浓缩，再对浓缩后水样进行固相萃取，固相萃取后的浓缩样品用于成组遗传毒性测试，可以更为简便、快捷、灵敏的测定水中的遗传毒性。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种城市饮用水水体遗传毒性的检测方法，包括：采用反渗透技术对水样进行处理；对经过反渗透处理的浓缩水样进行固相萃取；成组遗传毒性实验，测定水样的遗传毒性。具体步骤如下：(1)用反渗透技术对水样进行处理：先用纯水冲洗反渗透膜，去除反渗透膜的保护成分，然后将水样经过反渗透膜进行反渗透处理，收集得到反渗透后的浓水；(2)固相萃取：取步骤(1)得到的浓水，混合均匀后，经玻璃纤维素膜过滤，再用HLB柱富集，富集前HLB柱使用二氯甲烷、甲醇、纯水进行活化，然后用淋洗剂洗脱，洗脱液吹干，置换溶剂为DMSO，定容至5mL，得到待测样品；(3)成组遗传毒性实验：得到的待测样品分别进行Ames实验、重组大肠杆菌-SOS效应实验和彗星实验，测定得出水中遗传毒性效应的当量浓度。上述方法中，步骤(1)所述的反渗透膜的规格为4021。上述方法中，步骤(1)中用纯水冲洗反渗透膜时，冲洗速度为8L/min，反渗透处理时，膜的压力为0.1MPa，以80-100mL/min速度上样，产水率20％，收集得到3-4L反渗透后的浓水。上述方法中，步骤(1)中所述纯水的电导率为300us/cm，所述浓水电导率超过10000us/cm。上述方法中，步骤(2)中所述的玻璃纤维素膜孔径为0.45μm。上述方法中，步骤(2)中所述的HLB柱为500mg，OASIS，USA。上述方法中，步骤(2)中所述的淋洗剂为体积比1:1的正己烷/二氯甲烷和体积比为1:9的甲醇/二氯甲烷。上述方法中，步骤(3)中所述的Ames实验方法步骤为：采用平板掺入法，分别在加与不加S9活化系统的条件下进行。加热融化顶层培养基，取2mL分装于无菌试管中，50℃水浴保温；向保温的顶层培养基中依次加入：0.1mL测试菌液、0.1mL待测样品，加入0.5mL10％S9混合液，充分混匀，迅速倾入底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布，平放固化，37℃倒置培养48h，观察结果；试验同时设定阳性对照、溶剂对照和空白对照：阳性对照为标准诱变剂(2-氨基芴、甲基磺酸甲酯、敌克松和1,8-二羟基蒽醌)；溶剂对照使用二甲基亚砜和纯水；空白对照仅向培养基中加入菌液；每组培养皿做三个平行；结果以回变菌落数表示，任一菌株在加S9或未加S9条件待测样品组回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的2倍或2倍以上，且有剂量反应关系，并可重复者判定阳性结果。上述方法中，步骤(3)中所述的重组大肠杆菌-SOS效应实验方法步骤为：保藏的重组大肠杆菌30℃、180rpm经过夜培养后，转接于新鲜培养基37℃、200rpm振荡培养2h，与待测样品充分接触1.5h，收集细胞以PBS缓冲液洗涤2次，再以PBS悬浮，以超声波破碎细胞，以荧光光度计检测，激发波长为395nm，发射波长为507nm，R值＝待测样品荧光强度/相应空白，若与空白比值大于1.5，则认为该物质具有致突变性，呈阳性，对应标准毒性物质4-NQO剂量效应标准曲线，得出待测样品的4-NQO毒性当量：TEQ4-NQOμg/L。步骤中所述的重组大肠杆菌为携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌。上述方法中，步骤(3)中所述的彗星实验方法步骤为：选择小白鼠脾脏的淋巴细胞作为指示生物，以待测样品对小白鼠进行染毒处理后，制备单细胞悬浮液，制作三层胶板后，进行细胞裂解、对DNA进行解旋，通过电泳、中和及溴化乙锭(EB)染色后，在荧光显微镜下观察，用随机软件在自动曝光条件下拍照获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的各种参数；对应标准毒性物质Cr6+剂量效应标准曲线，得出待测样品的毒性当量：TEQCr6+mg/L。本专利技术采用的反渗透-固相萃取-成组遗传毒性实验方法能够有效的测定水体遗传毒性，对水样进行反渗透处理，反渗透膜不仅截留水中有机物的效率较高，而且对水样进行浓缩后得到较小体积的浓水便于固相萃取的进一步分离、纯化；采用固相萃取将浓水中的有机物进行分离、纯化和浓缩；成组遗传毒性实验从不同遗传毒性作用终点测定水体遗传毒性。从而提高了测定水体遗传毒性的综合性，解决了饮用水遗传毒性评价中水样前处理耗时久、有机试剂使用量大，单一遗传毒性检测方法不能综合评价水中遗传毒性的难题。本方法操作便利、费时少、检测敏感性较高、操作危险性较低，能够有效测定水体遗传毒性，对饮用水遗传毒性进行综合评价，有利于提升给水安全和饮用水安全保障能力。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。实施例1(一)采用本专利技术的检测步骤：(1)先用纯水冲洗4021反渗透膜，冲洗速度为8L/min；取某地表源水100L，反渗透处理时，以80-100mL/min的速度上水样进行反渗透处理，膜的压力为0.1MPa，得到反渗透浓水3.8L；(2)采集反渗透得到的浓水3.8L经0.45μm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种城市饮用水水体遗传毒性的检测方法，其特征在于，采用反渗透技术对水样进行处理；对经过反渗透处理的浓缩水样进行固相萃取；成组遗传毒性实验，测定水样的遗传毒性；具体步骤如下：1)采用反渗透技术对水样进行处理：先用纯水冲洗反渗透膜，去除反渗透膜的保护成分，然后将水样经过反渗透膜进行反渗透处理，得到反渗透后的浓水；2)固相萃取：取步骤1)得到的浓水，混合均匀后，经玻璃纤维素膜过滤，再用HLB柱富集，富集前HLB柱使用二氯甲烷、甲醇、纯水进行活化，然后用淋洗剂洗脱，洗脱液吹干，置换溶剂为DMSO，定容至5mL，得到待测样品；3)成组遗传毒性实验：得到的待测样品分别进行Ames实验、重组大肠杆菌‑SOS效应实验和彗星实验，测定得出水中遗传毒性效应的当量浓度。

【技术特征摘要】
1.一种城市饮用水水体遗传毒性的检测方法，其特征在于，采用反渗透技术对水样进行处理；对经过反渗透处理的浓缩水样进行固相萃取；成组遗传毒性实验，测定水样的遗传毒性；具体步骤如下：1)采用反渗透技术对水样进行处理：先用纯水冲洗反渗透膜，去除反渗透膜的保护成分，然后将水样经过反渗透膜进行反渗透处理，得到反渗透后的浓水；2)固相萃取：取步骤1)得到的浓水，混合均匀后，经玻璃纤维素膜过滤，再用HLB柱富集，富集前HLB柱使用二氯甲烷、甲醇、纯水进行活化，然后用淋洗剂洗脱，洗脱液吹干，置换溶剂为DMSO，定容至5mL，得到待测样品；3)成组遗传毒性实验：得到的待测样品分别进行Ames实验、重组大肠杆菌-SOS效应实验和彗星实验，测定得出水中遗传毒性效应的当量浓度。2.根据权利要求1所述的城市饮用水水体遗传毒性的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中所述反渗透膜的规格为4021。3.根据权利要求1所述的城市饮用水水体遗传毒性的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中用纯水冲洗反渗透膜时，冲洗速度为8L/min；反渗透处理时，膜的压力为0.1MPa，以80-100mL/min速度上样，产水率20％，收集得到3-4L反渗透后的浓水。4.根据权利要求1所述的城市饮用水水体遗传毒性的检测方法，其特征在于，步骤1)中所述纯水的电导率为300us/cm，所述浓水电导率超过10...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾瑞宝，孙韶华，逯南南，许燕，孙莉，
申请(专利权)人：山东省城市供排水水质监测中心，
类型：发明
国别省市：山东,37