一种多遗传终点生物组试验评价饮用水遗传毒性的方法技术

本发明专利技术公开了一种多遗传终点生物组试验评价饮用水遗传毒性的方法，所述方法以自来水厂滤池出水和消毒后水为研究对象，以生物组遗传毒性试验：Ames试验、体内微核小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、仓鼠卵巢细胞微核试验、SOS/umu试验为评价标准，当生物组遗传毒性试验中有3个阳性结果即表示存在生物遗传毒性安全性。本发明专利技术具有如下优点：①包含有基因突变、染色体畸变和DNA损伤三个遗传学终点；②试验生物包括原核、真核和哺乳类；③包括体内、体外试验；④包括性细胞和体细胞；⑤检测手段相对简便、快捷、经济及实验室通用性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于饮用水遗传毒性检测及评价领域，涉及一种生物组试验准确评价饮用水遗传毒性的方法。
技术介绍
随着高新技术产业的多元化，伴随着多种类、难降解的新生污染物质排入饮用水水源中，给饮用水安全带来了潜在的威胁。虽然饮用水技术得到了较大的发展，但对于纳米尺寸、痕量、亲水等有机物难于去除。此类物质通过协同作用、相加作用等方式联合作用于生物体，故理化分析方法无法反映多种污染物质作用对生物体的综合毒性效应和长期效应。另有研究表明，饮用水致突变性强弱与TOC或CODMn等指标并无对应关系，以3-氯-4(二氯甲基)-5-羟基-2(5H)-呋喃酮(MX)为例，其毒性可以和黄曲霉相比，是迄今为止在氯消毒自来水中发现的最强的致突变物质，其浓度为ng/L级，对TOC等贡献甚微，但对饮用水致突变性贡献可达11～67％，这意味着单项的理化水质指标和少数有毒物质的最高容许浓度尚不能完全保证饮用水的安全性，即使各项水质指标满足生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)106项水质标准，作为人们长期饮用的毒性蓄积，也可能存在一定的安全风险。目前已经建立的短期遗传毒性方法有200多种，分别检测基因突变、DNA损伤和染色体(组)畸变，很多研究者普遍使用其中的一到两种方法对水源水、自来水厂出水、管道出水等进行检验和评价。由于受试细胞或动物对有毒污染物质产生个体敏感性及特异性，会造成假阴性结果，造成对饮用水安全的误判，进而影响人类基因库的质量。所以，建立一种涵盖基因突变、DNA损伤和染色体(组)畸变的多遗传终点，涉及不同种类的受试动物，准确可行，快捷经济的方法势在必行。
技术实现思路
本专利技术针对
技术介绍
的实际问题，提供了一种多遗传终点生物组试验评价饮用水遗传毒性的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种多遗传终点生物组试验评价饮用水遗传毒性的方法，以自来水厂滤池出水和消毒后水为研究对象，以生物组遗传毒性试验：Ames试验、体内微核小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、仓鼠卵巢细胞微核试验、SOS/umu试验为评价标准，当生物组遗传毒性试验中有3个阳性结果即表示存在生物遗传毒性安全性。本专利技术具有如下优点：①包含有基因突变、染色体畸变和DNA损伤三个遗传学终点；②试验生物包括原核、真核和哺乳类；③包括体内、体外试验；④包括性细胞和体细胞；⑤检测手段相对简便、快捷、经济及实验室通用性好。附图说明图1为遗传毒性实验组合。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。具体实施方式一：本实施方式提供了一种涵盖多遗传终点评价饮用水遗传毒性的方法，其技术措施采用以下方案：目前检测遗传毒性方法方法虽多，从检测方法来分，大体上可分为下述三类：基因突变试验、染色体畸变试验和DNA损伤及修复试验。对于致突变试验选择应符合下列原则：①应该包含有多个遗传学终点；②试验生物包括原核、真核和哺乳类；③包括体内、体外试验；④包括性细胞和体细胞；⑤检测手段相对简便、快捷、经济及实验室通用性好等原则。另外，对于诱变性测试评价结果的权重价值按如下原则：(1)其测试生物的进化程度：哺乳动物＞其他高等真核生物＞低等真核生物＞原核生物；(2)染毒方式：体内＞体外；(3)靶cell：生殖cell＞体cell；(4)观察终点：基因突变≈染色体损伤＞遗传学意义不明的。鉴于上述，有人提出加权法，对每一种测试系统获得阳性结果赋予正值，无活化系统的数值大于有活化系统的，获得阴性结果则赋予负值，无活化系统的绝对值小于有活化系统的。鉴于上述原则，本实施方式提出了一种涵盖多遗传终点的方法评价饮用水遗传毒性，分别从基因突变、染色体畸变和DNA损伤三个遗传学终点建立一套方法，如图1所示。一、生物组遗传毒性试验预处理方法遗传毒性试验预处理方法采用两种，其中Ames试验、体内微核小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验以及小鼠精子畸形试验采用预处理模式一，而仓鼠卵巢细胞微核试验和SOS/umu试验采用预处理模式二。1、预处理模式一：采用固相萃取法，以XAD-2型树脂为吸附树脂，颗粒度40～60目。使用前将树脂用重蒸甲醇、丙酮各提取8h，装入磨口瓶中以重蒸甲醇浸泡备用。将精制过的树脂湿法装入特制的玻璃吸附柱中至树脂床高110mm，并在吸附柱底部和树脂床上铺经甲醇和丙酮提取过得玻璃丝。然后放出甲醇，至甲醇恰好达树脂床顶部为止，然后用1000～1200ml蒸馏水分5～6次冲洗树脂柱，冲洗净残存甲醇后，保留树脂柱被蒸馏水覆盖，以防进气。吸附柱上端通过医用滴管与盛水容器相连，利用虹吸作用通过调节螺旋夹控制水样流经树脂床的流速为50～70mL/min，过柱水的总体积为250L。过柱完毕，用60～80ml重蒸的乙醚洗脱，首次洗脱时使乙醚在柱子中存留30～40min。洗脱液收集到烧杯中并加入经马弗炉于600℃烘干3h后的无水硫酸钠进行脱水处理，最后用转移到KD浓缩器于43℃水浴的条件下浓缩至1ml以下，4℃冰箱保存备用。2、预处理模式二：采样瓶采用5L清洁、干燥棕色玻璃瓶。采集水样时，瓶内用待测水样润洗3次，每种水样采集10L。所有水样使用直径为142mm的Millipore微滤系统和孔径0.7μm的APFF玻璃纤维滤膜(美国Millipore)过滤后再经活化后的HLB柱富集。HLB柱采用二氯甲烷和甲醇活化柱子。将水样通过样品管连接至活化好的HLB柱，每根HLB柱富集水样2升，富集完毕并抽干水后，以10mL二氯甲烷为淋洗剂分三次(第一次4mL、第二次3mL和第三次3mL)进行洗脱，旋蒸浓缩后，添加经脱水的无水硫酸钠，用柔和高纯氮气吹干后置换0.2mL生物实验溶剂DMSO于-20℃冰箱保存用于遗传毒性生物测试。二、生物组遗传毒性试验方法1、Ames试验方法方法简述如下：试验设计为四个剂量组，换算成有机富集物的水的体积计，也即相当于水样的体积为7L/皿、5L/皿、3L/皿和1L/皿4个水量(剂量)梯度，除了上述的4个剂量组外，还设有空白对照组(自发回变)、溶剂对照组(DMSO组)和阳性对照组(TA98是采用的Dexon，TA100是采用的NaN3)。本试验采用平板掺入法，试验中向融化的顶层培养基中，依次注入试验菌株增菌液0.1mL和受试物溶液(预处理后的水样)0.1mL，将其混匀后注入到底层培养基平板上，并在37℃条件下培养48h，然后计数每皿的回变菌落数。每次试验每个剂量做3个平行皿，在相同试验条件下再重复一次，最后以6皿平均值计算试验结果。2、SOS/umu试验方法：将-80℃冷冻复苏TA1535/PSK1002菌液取适量加入适量含氨比西林的LB培养基(溶菌肉汤培养基，用于生化分子实验预培养菌种)中，保持温度37℃，进行振荡隔夜培养。第二天，使用TGA培养液对菌液提前培养1h，试验分别在+S9(间接遗传毒性)和-S9(直接遗传毒性)下开展。测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多遗传终点生物组试验评价饮用水遗传毒性的方法，其特征在于所述方法以自来水厂滤池出水和消毒后水为研究对象，以生物组遗传毒性试验：Ames试验、体内微核小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、仓鼠卵巢细胞微核试验、SOS/umu试验为评价标准，当生物组遗传毒性试验中有3个阳性结果即表示存在生物遗传毒性安全性。

【技术特征摘要】
1.一种多遗传终点生物组试验评价饮用水遗传毒性的方法，其
特征在于所述方法以自来水厂滤池出水和消毒后水为研究对象，以生
物组遗传毒性试验：Ames试验、体内微核小鼠骨髓嗜多染红细胞微
核试验、小鼠精子畸形试验、仓鼠卵巢细胞微核试验、SOS/umu试验
为评价标准，当生物组遗传毒性试验中有3个阳性结果即表示存在生
物遗传毒性安全性。
2.根据权利要求1所述的多遗传终点生物组试验评价饮用水遗
传毒性的方法，其特征在于所述生物组遗传毒性试验进行之前，须对
研究对象进行预处理，其中，Ames试验、体内微核小鼠骨髓嗜多染
红细胞微核试验以及小鼠精子畸形试验采用同一预处理模式，仓鼠卵
巢细胞微核试验和SOS/umu试验采用同一预处理模式。
3.根据权利要求2所述的多遗传终点生物组试验评价饮用水遗
传毒性的方法，其特征在于所Ames试验、体内微核小鼠骨髓嗜多染
红细胞微核试验以及小鼠精子畸形试验的预处理模式采用固相萃取
法，以XAD-2型树脂为吸附树脂，具体步骤如下：
(1)使用前将树脂用重蒸甲醇、丙酮各提取8h，装入磨口瓶中
以重蒸甲醇浸泡备用；
(2)将树脂湿法装入的玻璃吸附柱中至树脂床
高110mm，并在吸附柱底部和树脂床上铺经甲醇和丙酮提取过得玻璃
丝，然后放出甲醇，至甲醇恰好达树脂床顶部为止；
(3)用1000～1200ml蒸馏水分5～6次冲洗树脂柱，冲洗净残

\t存甲醇后，保留树脂柱被蒸馏水覆盖，以防进气；
(4)吸附柱上端通过医用滴管与盛水容器相连，利用虹吸作用
通过调节螺旋夹控制水样流经树脂床的流速为50～70mL/min，过柱
水的总体积为250L；
(5)过柱完毕，用60～8...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐勇鹏，崔福义，陈停，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23