本发明专利技术属于生物技术领域，具体地说，本发明专利技术涉及一种猪传染性胃肠炎病毒疫苗的制备。所述疫苗由灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂按照体积比为1:2-3配制。本发明专利技术在18只6周龄SPF级昆明乳鼠和猪体上对疫苗进行安全评价，其中粒径70nm、150nm的纳米硅TGEV灭活疫苗组诱导的IgG和IgA的抗体水平均高于其它各实验组，其中150nm组的抗体水平最高；在对CD4+/CD8+比值的检测结果表明，在首免后第1周，70nm组CD4+/CD8+比值明显高于其它各试验组；在第2周，70nm组和油乳剂组CD4+/CD8+比值较高，明显高于市售铝胶佐剂组。本发明专利技术猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂疫苗具有无遗传毒性，无免疫原性，不引起机体产生免疫反应，可靶向输送药物，有缓释作用的优越性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，本专利技术具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪传染性胃肠炎(Transmissiblegastroenteritisofpigs，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirusofswine，TGEV)引起的高度接触性传染病，该病显著的临床症状为严重腹泻、呕吐和脱水等。此病属于国际兽医局(OIE)法典中B类疫病。各品种和各饲养阶段的猪对本病均易感，这是由于仔猪的肠道内还没有建立起稳定的微生态系统，自身抵抗力较弱，易受各种病原微生物的侵袭和各种应激因素的影响，其中两周龄以内的仔猪死亡率最高，可达100％。而随着日龄的增加，5周龄以上仔猪死亡率开始降低，成年猪几乎没有死亡，但有很多不良后果，常常造成饲料报酬率和生产性能下降，这给畜牧业带来极大的经济损失。1946年，Doyle和HutChings两位学者在美国首次对该病作了比较详细的报道，1956和1957年，该病相继在日本和英国发生。随之欧洲、美洲以及亚洲的大部分国家相继报道了本病。从此，该病受到世界各个国家的高度关注和重视，而我国就本病的报道始于上世纪60年代末。近年来该病毒与轮状病毒、流行性腹泻病毒混合感染的流行的趋势加剧。我国多数省份均有本病的发生，给中国养猪业乃至整个畜牧业带来了严重危害。TGE是一种局部感染性疾病，该病治疗效果差，重在预防。实际生产常采用疫苗接种来获得免疫保护力，但畜牧行业目前所使用的疫苗在不同程度上存在免疫效果不理想，潜伏感染，重组复活，毒力返祖以及排毒散毒等不足。研发新型、安全性疫苗，从而达到有效防制TGE是一个亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗及其制备方法。本专利技术的技术方案是：猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗，所述疫苗由灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂以质量比为1:2-3的比例混合制成。所述纳米硅胶的粒径为50-200nm，浓度为1mg/ml。所述纳米硅胶的粒径为70-90nm。所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗的制备方法，它的步骤如下：(1)将猪传染性胃肠炎病毒增殖、纯化、灭活，得到灭活的猪传染性胃肠炎病毒液；(2)制备纳米硅胶；(3)将灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂混合后，充分震荡均匀、4-6℃静置，得到猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗。所述步骤(2)中将正硅酸乙酯和乙醇混合后，得到反应液，将氨水调pH为9-10，将氨水加入到反应液中，在转速为750-800rpm的条件下，搅拌3～5分钟，然后在200-400rpm的条件下搅拌12至16h，得到纳米硅胶。本专利技术的有益效果在于：本专利技术在18只6周龄SPF级昆明乳鼠和猪体上对疫苗进行安全评价，其中粒径70nm、150nm的纳米硅TGEV灭活疫苗组诱导的IgG和IgA的抗体水平均高于其它各实验组，其中150nm组的抗体水平最高；在对CD4+/CD8+比值的检测结果表明，在首免后第1周，70nm组CD4+/CD8+比值明显高于其它各试验组；在第2周，70nm组和油乳剂组CD4+/CD8+比值较高，明显高于市售铝胶佐剂组。这说明各试验均能加强小鼠的细胞免疫状态，其中佐剂为纳米二氧化硅的70nm组免疫增强效果最佳。本专利技术猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂疫苗具有无遗传毒性，无免疫原性，不引起机体产生免疫反应，可靶向输送药物，有缓释作用的优越性。附图说明图1为粒径为70nm纳米的二氧化硅电镜图×60000；图2为粒径为150nm纳米的二氧化硅电镜图×60000；图3为免疫后不同时间血清中IgG含量标准曲线；图4为特异性IgG抗体含量标准曲线；图5为免疫后不同时间血清中IgG含量；图6为IgA含量标准曲线；图7为免疫后不同时间血清中IgA含量；图8为免疫后小鼠外周血CD3+细胞所占百分比；图9为免疫后小鼠外周血CD4+细胞所占百分比；图10为免疫后小鼠外周血CD8+细胞所占百分比；图11为免疫后小鼠外周血CD4+/CD8+的动态变化。具体实施方式猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗，所述疫苗由灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂以质量比为1:2-3的比例混合制成。所述纳米硅胶的粒径为50-200nm，浓度为1mg/ml。所述纳米硅胶的粒径为70-90nm。所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗的制备方法，它的步骤如下：(1)将猪传染性胃肠炎病毒增殖、纯化、灭活，得到灭活的猪传染性胃肠炎病毒液；(2)将正硅酸乙酯和乙醇混合后，得到反应液，将氨水调pH为9-10，将氨水加入到反应液中，在转速为750-800rpm的条件下，搅拌3～5分钟，然后在200-400rpm的条件下搅拌12至16h，得到纳米硅胶；(3)将灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂混合后，充分震荡均匀、4-6℃静置，得到猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗。本专利技术具体操作如下：一、不同佐剂猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗的制备1材料与方法1.1材料1.1.1病毒株和细胞株ST细胞购自中国兽药监察所，由本试验室冻存；猪传染性胃肠炎病毒(TGEVHN-2012)由河南省动物性食品安全重点试验室分离鉴定、纯化并保存。1.1.2试验动物6周龄SPF级昆明乳鼠18只，购自河南省试验动物中心；许可证号为：SCXK(豫)2010-0002；编码为No.41003100000673。1.1.3主要仪器小型台式离心机，购自德国Sigma公司；MiLLipak40型超纯水制备系统，购自德国MiLLipore公司；AB204-N电子分析天平，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，购自上海亚荣生化仪器厂；超净工作台，购自苏州安泰空气技术有限公司；LEICADMIL倒置显微镜，购自德国莱卡公司；CO2培养箱，购自美国ThermoForma公司；fj200s数显高速分散均质机，购自上海索映仪器设备有限公司。1.1.4主要试剂“四季青”胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；RPMI-1640培养液购自GIBCOBR公司；甲醛溶液(分析纯)购自西陇化工股份有限公司；0.25％胰蛋白酶、吐温-80均购自Solarbio公司；司本-80购自上海申宇医药化工有限公司；MONTANIDEISA206VG成品白油佐剂为法国赛比克公司产品；本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗，其特征在于：所述疫苗由灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂以质量比为1:2‑3的比例混合制成。
【技术特征摘要】
1.猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗，其特征在于：所述疫苗由灭活的猪传染性胃肠炎病毒液与纳米硅胶佐剂以质量比为1:2-3的比例混合制成。
2.如权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗，其特征在于：所述纳米硅胶的粒径为50-200nm，浓度为1mg/ml。
3.如权利要求2所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗，其特征在于：所述纳米硅胶的粒径为70-90nm。
4.如权利要求1或2或3所述的猪传染性胃肠炎病毒纳米硅佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：
（1）将猪传染性胃肠炎病...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏战勇，杨国宇，胡慧，宋美荣，徐端红，寇亚楠，徐卫松，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41
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