一种生物发酵液中聚苹果酸的提纯方法技术

本发明专利技术公开了一种生物发酵液中聚苹果酸的提纯方法，包括制备聚苹果酸发酵液；除去发酵液中的菌体等不溶物；一次脱色；超滤除大分子多糖；纳滤除小分子杂质；二次脱色；冷冻干燥。采用板框过滤、超滤、纳滤技术、酶解和脱色的方法提取纯化生物发酵液中的聚苹果酸。使用多级膜分离技术，整个过程未添加有机溶剂，主要是利用物理的方法除去发酵液中的杂质，得到含量和纯度都较高的聚苹果酸。

【技术实现步骤摘要】
一种生物发酵液中聚苹果酸的提纯方法
本专利技术属于生物合成和提纯
，尤其是涉及一种生物发酵液中聚苹果酸的提纯方法。
技术介绍
聚苹果酸[poly(β-)malicacid，以下简称PMLA]是一种以苹果酸为唯一单体的高分子聚酯类化合物。PMLA及其衍生物是一类新型的生物高分子材料，具有特殊的立体结构，主链上带有酯基，在水环境条件下可发生自发或酶促降解。其单体苹果酸广泛存在于各种生物中，参与生物体的三羧酸循环代谢途径。PMLA的侧链上含有若干个亲水性极强的羧基基团，因此PMLA的主要性质体现在具有高度的水溶性、吸水性、可吸收性、生物相容性、可降解性、可化学衍生性无毒性及无免疫原性等，这些独特的性质决定了PMLA成为一种具有广泛应用前景的高分子聚合物。PMLA在生物医药及生物材料领域均存在着广泛的应用前景，PMLA也有潜力被用于可生物降解的塑料和洗涤剂中。PMLA可以很容易地水解成苹果酸，广泛用于食品和化妆品中的二羧酸行业。和其他二羧酸一样，苹果酸也具有作为C4化学结构单元的潜力；此外，PMLA还有望用于制备纳米微胶囊、透析袋、高分子胶束，还可以应用到受损骨骼的修复方面；因其具有良好的保湿性及水溶性，也可以应用到食品包装和化妆产品等领域。PMLA的制备可以分为化学合成法和生物合成法，生物合成方法可以保证高的光学纯度，而化学方法能够合成更多种类的产物。化学法合成的方法较多，但是化学合成法成本高、操作条件苛刻、污染重，得到聚合物的分子量比生物发酵得到的聚合物分子量低，化学法合成的分子量最多只能达到174kDa，而发酵法最高可达200-760kDa，且发酵法生产的PMLA都是β型的。目前国内PMLA生产面临的瓶颈主要有以下几个方面：1、发酵过程中因出芽短梗霉会产生黑、黄绿色素等物质，从而使得色素较难去除；2、发酵过程中因产生大量的普鲁兰多糖，使得糖与PMLA难分离；3、传统工艺中，采用有机溶剂醇沉或者离子交换树脂等方法进行PMLA提取，这将导致生产成本的增加以及工业化大生产时的安全隐患。虽然从生物技术途径已经能够提供克级的PMLA的钠盐、钙盐、钾盐或自由酸，但由于PMLA的发酵周期较长，提取工艺大多以有机溶剂沉淀为主，对环境危害大、耗资高等方面因素的影响，PMLA的大规模生产仍然受到了很大的限制。与PMLA相关的文章及专利中涉及PMLA的应用及发酵方面的较多，而关于提取方法的相对较少。并且我国的这些相关研究和报道也仅处于实验室水平，真正进行工业生产的还没有。要实现发酵法制备PMLA的产业化，就必须对发酵液中的PMLA的分离提纯工艺进行优化。
技术实现思路
为解决上述存在的技术问题，本专利技术的目的是提供一种生物发酵液中聚苹果酸的提纯方法，利用超滤纳滤技术从PMLA发酵液中高效提取和纯化PMLA，使用膜分离技术，整个过程未添加有机溶剂，主要是利用物理的方法除去发酵液中的杂质，利用膜技术得到含量和纯度都较高的PMLA。本专利技术的技术方案如下：1.一种生物发酵液中聚苹果酸的提纯方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：1）制备聚苹果酸发酵液；2）除菌体和培养基中未被利用的碳酸钙等不溶物：根据步骤1）制备的聚苹果酸发酵液粘度的不同向PMLA发酵液中加入去离子水稀释1~2倍，调整发酵液粘度在45~50mPa·s之间，板框过滤除菌体和不溶物；然后加入活性炭进行一次脱色；3)超滤除多糖及大分子杂质：用去离子水将步骤2）一次脱色后的发酵液中聚苹果酸的浓度调整为10~30g/L，通过超滤膜进行超滤，溶液温度控制为30~50℃，操作压力控制为0.2~0.5Mpa，超滤至发酵液体积浓缩为超滤前体积的1/2时，加水洗脱，加水量为超滤前体积的1/2，如此重复1~3次加水洗脱；4）酶解进一步去除多糖：向步骤3）的超滤透过液中分别加入1%~2%（v/v）的普鲁兰酶和1%~2%（m/v）的糖化酶，进行酶解；5）纳滤除小分子氨基酸、寡糖、盐离子等小分子杂质：将经过步骤4）酶解处理后的发酵液通过纳滤膜进行纳滤，溶液温度控制为30~50℃，操作压力控制为0.4~1.0Mpa，纳滤浓缩至发酵液体积为纳滤前体积的1/2时，加水洗脱，加水量为纳滤前体积的1/2，如此重复1~3次加水洗脱；然后二次脱色；冷冻干燥后制得白色的聚苹果酸产品。更进一步的，所述的制备PMLA发酵液的方法包括以下步骤：1）菌种活化：将出芽短梗霉A.pullulansCGMCC3337菌株转接到固体斜面培养基上于25℃恒温培养箱中培养4-5天；2）种子培养：取出活化后的斜面种子，用无菌生理盐水将斜面的孢子洗下，制成孢子悬液；然后按照10%（v/v）的接种量，接入到种子培养基中；培养条件：温度25℃，转速200r/min，培养40个小时至对数生长期；3）发酵培养：将种子培养基接入到发酵培养基中，接种量为10%，发酵罐为5L，装液量为60%，发酵条件：恒定发酵温度25℃，通风比1:1.2，转速为450rpm，发酵时间144h，得聚苹果酸的发酵液，下罐聚苹果酸的产量为25g/L~35g/L。更进一步的，步骤1）中生物发酵法制备的聚苹果酸发酵液粘度为90~150mPa·s。优选的，步骤2）中板框过滤是为了除菌体和不溶物，采用800~1000目滤布预涂硅藻土，硅藻土加入量为1%~2%（m/v），操作压力为0.15~0.2Mpa。更进一步的，步骤2）中一次脱色是将除菌体和不溶物后的发酵液加热到50~70℃后，加入1%~1.5%（m/v）活性炭进行搅拌脱色60~120min，搅拌速度为100r/min；然后进行板框过滤除活性炭，采用800~1000目滤布预涂硅藻土，硅藻土加入量为1%~1.5%（m/v），操作压力为0.15~0.2Mpa。更进一步的，所述步骤3）中超滤采用的超滤膜是聚醚砜超滤膜，截留分子量为5~30KDa。更进一步的，步骤4）中酶解的温度为40~50℃，搅拌速度100r/min，反应时间8~12小时。更进一步的，所述步骤5）中纳滤采用的纳滤膜为复合聚酰胺纳滤膜，截留分子量为300Da。更进一步的，步骤5）的二次脱色是将纳滤截留液加热到50~70℃后，加入1%~1.5%（m/v）活性炭进行脱色，搅拌速度100r/min，脱色60~120min，抽滤除去活性炭。更进一步的，步骤5）的冷冻干燥是将二次脱色后的发酵液加热至60~70℃，使用旋转蒸发仪浓缩至PMLA含量为15~25g/100mL，经冷冻干燥制得白色的聚苹果酸产品。本技术方案设计原理1、本专利技术对聚苹果酸发酵液的提纯方法：板框过滤除去菌体和不溶物；一次脱色，采用板框过滤进一步除去菌体和活性炭；超滤除去大分子多糖和大分子杂质，同时进一步除去活性炭，保护小孔径的纳滤膜不被污染，保证纳滤处理的效果，确保多糖被去除的更充分；多糖的进一步去除是通过普鲁兰酶和糖化酶酶解，酶解产物为麦芽三糖、葡萄糖等小分子糖类；此时再进行纳滤处理主要是除去小分子的酶解产物和盐离子等小分子的杂质。2、酶解采用的普鲁兰酶和糖化酶两种酶进行酶解，因为发酵产物普鲁兰多糖分子的侧链上以糖苷键连接糖基团，其中普鲁兰酶可以酶解糖基团侧链上的α-1,6糖苷键，糖化酶可以酶解侧链上的α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键，但对α-1,6糖苷键作用较弱，本专利技术添加糖化酶后对糖的酶解更本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物发酵液中聚苹果酸的提纯方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：1）制备聚苹果酸发酵液；2）向步骤1）制备的聚苹果酸发酵液中加入去离子水稀释1~2倍，至发酵液粘度在45~50mPa·s之间，板框过滤，然后进行一次脱色；3）用去离子水将一次脱色后发酵液中的聚苹果酸浓度调整为10~30g/L，通过超滤膜进行超滤，溶液温度控制为30~50℃，操作压力控制为0.2~0.5Mpa，超滤至发酵液体积浓缩为超滤前体积的1/2时，加水洗脱，加水量为超滤前体积的1/2，重复1~3次加水洗脱；4)向步骤3）的超滤透过液中分别加入1%~2%（v/v）的普鲁兰酶和1%~2%（m/v）的糖化酶，进行酶解；5）将经过步骤4）酶解后的发酵液通过纳滤膜进行纳滤，溶液温度控制为30~50℃，操作压力控制为0.4~1.0Mpa，纳滤浓缩至发酵液体积为纳滤前体积的1/2时，加水洗脱，加水量为纳滤前体积的1/2，重复1~3次加水洗脱；然后二次脱色、冷冻干燥得聚苹果酸产品。

【技术特征摘要】
1.一种生物发酵液中聚苹果酸的提纯方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：1）制备聚苹果酸发酵液；2）向步骤1）制备的聚苹果酸发酵液中加入去离子水稀释1~2倍，至发酵液粘度在45~50mPa·s之间，板框过滤，然后进行一次脱色；3）用去离子水将一次脱色后发酵液中的聚苹果酸浓度调整为10~30g/L，通过超滤膜进行超滤，溶液温度控制为30~50℃，操作压力控制为0.2~0.5Mpa，超滤至发酵液体积浓缩为超滤前体积的1/2时，加水洗脱，加水量为超滤前体积的1/2，重复1~3次加水洗脱；4)向步骤3）的超滤透过液中分别加入1%~2%（v/v）的普鲁兰酶和1%~2%（m/v）的糖化酶，进行酶解；5）将经过步骤4）酶解后的发酵液通过纳滤膜进行纳滤，溶液温度控制为30~50℃，操作压力控制为0.4~1.0Mpa，纳滤浓缩至发酵液体积为纳滤前体积的1/2时，加水洗脱，加水量为纳滤前体积的1/2，重复1~3次加水洗脱；然后二次脱色、冷冻干燥得聚苹果酸产品。2.根据权利要求1所述的一种生物发酵液中聚苹果酸的提纯方法，其特征在于，所述的制备聚苹果酸发酵液包括以下步骤：1）菌种活化：将出芽短梗霉A.pullulansCGMCC3337菌株转接到固体斜面培养基上于25℃恒温培养箱中培养4-5天；2）种子培养：取出活化后的斜面种子，用无菌生理盐水将斜面的孢子洗下，制成孢子悬液；然后按照10%（v/v）的接种量，接入到种子培养基中；培养条件：温度25℃，转速200r/min，培养40个小时至对数生长期；3）发酵培养：将种子培养基接入到发酵培养基中，接种量为10%，发酵罐为5L，装液量为60%，发酵条件：恒定发酵温度25℃，通风比1:1.2，转速为450rpm，发酵时间144h，得聚苹果酸的发酵液。3.根据权利要求1所述的一种生物发酵液中聚苹果酸的提纯方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，王帅，李雪，郝利民，张卫，
申请(专利权)人：天津北洋百川生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12