The present invention relates to the culture field of cells in vitro, in particular to a method of isolation and culture of a chicken GHR deletion mutant myoblast. The present invention by the chicken GHR gene deletion mutant dwarf chicken as material by collagenase and trypsin digestion and differential adherence method for GHR gene deletion mutant dwarf chicken into isolated muscle cell culture and immunofluorescence was used to identify the specificity, provides a new method for cultivation of chicken GHR deletion mutants separated into muscle cells.
【技术实现步骤摘要】
一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法
本专利技术涉及细胞的体外培养领域,具体涉及一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法。
技术介绍
成肌细胞位于骨骼肌细胞膜和细胞基膜之间,主要来源于动物胚胎的中胚层,属于单核梭型细胞。动物的成肌细胞最早于1961年从青蛙的骨骼肌肌纤维中发现并分离培养。研究表明,成肌细胞在动物的骨骼肌生长、发育、修复与维持中发挥极其重要的作用。通过多年的研究,人们发现体外分离培养培养的成肌细胞可广泛应用在遗传分析、基因功能鉴定、基因治疗、组织工程等许多领域。成肌细胞主要以单核小圆形细胞分布于肌纤维外周。当骨骼肌遭受外界刺激或受到损伤后,成肌细胞被激活并表达生肌调节因子,融合形成新的肌核从而导致骨骼肌纤维的肥大和延伸,使骨骼肌的结构和功能得以恢复。目前已发现的矮小型鸡共有8种类型,其中由性连锁矮小型基因(dw)引起的矮小型鸡,因GHR基因缺失突变引起,在鸡的育种实践中具有广泛用途,主要是这一突变可使鸡的体重降低30%左右,具有体型变小、耗料减少、饲养成本降低等优点。因此,开展对GHR基因缺失突变引起的性连锁矮小鸡的骨骼肌生长、发育的遗传机制的研究具有重要的理论和实践意义。因此,需要对GHR缺失型矮小鸡的成肌细胞进行体外分离培养培养,以为矮小型鸡骨骼肌生长和发育的细胞生物学机制及分子机理研究提供技术和手段支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供是鸡提供GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的:一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法,包括以下步骤:(1)取孵化至11天龄的GHR缺 ...
【技术保护点】
一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)取孵化至11天龄的GHR缺失型矮小鸡鸡胚,用75%的酒精涂抹蛋壳表面进行彻底消毒;沿着鸡蛋气室边缘将蛋壳剪开,取出鸡胚并保持胚体完整,将两侧腿部从胚体分离出来,置于含有20%FBS的DMEM培养液中;(2)剔除血管、脂肪,用洗涤液洗涤3次后,将肌肉组织剪碎后放入离心管中,离心后静置,分离后在离心管底部得到肌肉组织;(3)将0.1%的胶原酶Ⅰ加入离心管中,消化30分钟;加入0.25%的胰酶,继续消化1小时,再加入含20%FBS的DMEM培养基终止消化;(4)使用200目筛过滤并收集滤液,离心后除去上清液,得到成肌细胞;(5)加入含15%FBS的DMEM培养液使细胞重新悬浮,然后转移至培养皿中,置于细胞培养箱中培育;(6)观察到培养的细胞贴壁生长达到90%时,除去原来的培养液后,用PBS溶液冲洗;加入2mL 0.25%胰酶消化液作用1分钟,最后加入含血清的完全培养基终止消化;(7)离心除去上清液后,加入含血清的完全培养基中,按照1:3的比例接种到新的培养瓶中继续培养后,即得鸡GHR缺失型突变体成肌细胞。
【技术特征摘要】
1.一种鸡GHR缺失型突变体成肌细胞的分离培养方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)取孵化至11天龄的GHR缺失型矮小鸡鸡胚,用75%的酒精涂抹蛋壳表面进行彻底消毒;沿着鸡蛋气室边缘将蛋壳剪开,取出鸡胚并保持胚体完整,将两侧腿部从胚体分离出来,置于含有20%FBS的DMEM培养液中;(2)剔除血管、脂肪,用洗涤液洗涤3次后,将肌肉组织剪碎后放入离心管中,离心后静置,分离后在离心管底部得到肌肉组织;(3)将0.1%的胶原酶Ⅰ加入离心管中,消化30分钟;加入0.25%的胰酶,继续消化1小时,再加入含20%FBS的DMEM培养基终止消化;(4)使用200目筛过滤并收集滤液,离心后除去上清液,得到成肌细胞;(5)加入含15%FBS的DMEM培养液使细胞重新悬浮,然后转移至培养皿中,置于细胞培养箱中培育;(6)观察到培养的细胞贴壁生长达到90%时,除去原来的培养液后,用PBS溶液冲洗;加入2mL0.25%胰酶消化液作用1分钟,最后加入含血清的完全培养基终止消化;(7)离心除去上清液后,加入含血清的完全培养基中,按照...
【专利技术属性】
技术研发人员:林树茂,李升广,张绮琼,郭金彪,岳孝亭,
申请(专利权)人:佛山科学技术学院,
类型:发明
国别省市:广东,44
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