一种诱导成纤维细胞为脂肪细胞样细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种诱导成纤维细胞为脂肪细胞样细胞的方法，属于细胞生物学领域。该方法针对当前将成纤维细胞转分化为脂肪细胞方法中普遍存在的需载体介导和转基因操作、实验设施和技术水平要求较高、产生的脂肪细胞安全性较差等问题，发明专利技术了一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞重编程为脂肪细胞样细胞的方法。由于利用该方法产生的脂肪细胞样细胞仅通过鱼卵母细胞提取物的诱导和脂肪细胞定向诱导培养获得，不涉及外源基因插入，实验操作相对简单，产生的脂肪细胞样细胞安全性相对较好，在脂肪组织代谢及调控研究等领域具有广阔的应用前景。

A method for inducing fibroblasts to be adipocyte like cells

The present invention relates to a method for inducing fibroblasts to be adipocyte like cells, which belongs to the field of cell biology. The method to resolve the problem of the fibroblasts to differentiate into fat cell method existed in the carrier mediated and transgenic operation, experimental facilities and technology for the higher level, the fat cells of poor security, invented a method using fish oocyte extracts induced reprogramming of fibroblasts into adipocytes like cells. The fat cells generated by this method of inducing culture obtained only by induction and fat cell directional fish oocyte extracts, does not involve the insertion of foreign gene, the operation is relatively simple, fat cells have relatively good safety, has broad application prospects in the field of adipose tissue metabolism and regulation research.

【技术实现步骤摘要】
一种诱导成纤维细胞为脂肪细胞样细胞的方法
本专利技术涉及一种诱导成纤维细胞为脂肪细胞样细胞的方法，属于细胞生物学

技术介绍
肥胖是一种较为常见的脂肪组织代谢紊乱性疾病，并由此可引发高血压、心脏病、糖尿病以及癌症等（GalicS,etal.,2010;AilhaudG,etal.,1992）。系统、深入研究脂肪组织代谢规律与调控机制对于肥胖的治疗和预防具有重要意义。目前用于研究脂肪组织代谢与调控规律的细胞主要包括由原代培养获得的前体脂肪细胞和商品化的用于产生脂肪细胞的细胞系。通常，由原代培养获得的前体脂肪细胞与研究对象具有相同或相似的遗传特征，是研究脂肪细胞基因表达调控最佳的细胞类型，但目前，原代前体脂肪细胞在培养方法和鉴定上仍不太成熟。用于产生脂肪细胞的商品化细胞系主要是基于小鼠胚胎成纤维细胞建立的细胞系，包括3T3-L1、3T3-F442A、NIH-3T3和C3H10T1/2，其中，3T3-L1和3T3-F442A是研究脂肪细胞最为常用的前体脂肪细胞系，需要在特定条件下诱导才能转变为脂肪细胞，NIH-3T3和C3H10T1/2细胞系与前二者不同，它们为非定向前体脂肪细胞系，二者分化为脂肪细胞前一般需进行转基因操作、过表达某些基因才能转变为脂肪细胞，尤其是过表达C/EBPα和PPARγ基因。此外，由于小鼠和人的进化距离较远，小鼠和人的脂肪细胞在代谢规律上也不完全一致，利用小鼠的细胞系来研究人，其代表性也较差。因此，在人的肥胖研究方面，建立一种切实可行的、用于产生脂肪细胞的新方法显得极为重要。目前，已证实胚胎干细胞、间充质干细胞等类型的干细胞在一定条件下能够分化为脂肪细胞（DanicC,etal.,1997;TangQ,etal.,2004）。但由于胚胎干细胞的使用存在严重的伦理问题，因此，在人上将胚胎干细胞诱导分化为脂肪细胞存在极大限制；间充质干细胞是一种来源于骨髓、牙髓、脂肪、脐带等组织的干细胞类型，这类干细胞在一定条件下能够分化为脂肪细胞，但存在的问题是干细胞数量限制和分化效率较低。谱系重编程（Lineagereprogramming）技术的专利技术为脂肪细胞的来源提供了新的途径。谱系重编程技术是指不经过多能干细胞阶段，直接将已经分化的成熟细胞转换为另一种成熟细胞的方法。目前，国内外科学家已利用谱系重编程技术将体细胞转分化为神经细胞、心肌细胞、内皮细胞和肝细胞等（WadaR,etal.,2013;HuangP,etal.,2011;ShengC,etal.,2012）。但目前，仍未见利用此方法将成体细胞转分化为脂肪细胞的方法和研究。即便如此，谱系重编程技术大多依赖于转基因的方法使细胞发生转化，其安全性较差。基于全化学物质诱导的转分化技术目前诱导效率较低（ChengL,etal.,2014;ParkG,etal.,2015），且化学分子对细胞潜在的损伤也难以鉴定。基于以上分析，脂肪细胞的来源仍存在许多问题，亟待寻找一种诱导方法相对简单、安全性相对较好的脂肪细胞诱导方法。基于此，本专利技术尝试专利技术了一种利用鱼卵母细胞提取物作为诱导剂，将成纤维细胞先进行重编程操作，进一步利用脂肪细胞诱导分化培养基和维持培养基对重编程细胞进行交替诱导，获得脂肪细胞样细胞的方法（鉴于学术严谨性，诱导的脂肪细胞和正常脂肪细胞在表观遗传模式方面可能不完全相同，因此，本专利技术专利将诱导后油红O染色阳性的细胞称为脂肪细胞样细胞）。本专利技术方法所有步骤均不涉及转基因操作，产生的脂肪细胞样细胞安全性好，实验操作相对简单，实验的重复性也较好。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种实验操作相对简单、实验重复性相对较好、产生的脂肪细胞样细胞安全性相对较好的脂肪细胞样细胞诱导方法。本专利技术所提供的诱导成纤维细胞为脂肪细胞样细胞的方法，包括以下步骤。（1）成纤维细胞的制备：包括成纤维细胞的分离、鉴定和培养。（2）诱导剂的制备：诱导成纤维细胞重编程的诱导剂为鱼卵母细胞提取物。（3）成纤维细胞的诱导：利用所述步骤（2）中制备的鱼卵母细胞提取物对所述步骤（1）中制备的成纤维细胞进行诱导，通过诱导，使成纤维细胞重编程为具有多向分化潜能的诱导多能干细胞。（4）诱导多能干细胞向脂肪细胞样细胞的分化：将所述步骤（3）中获得的诱导多能干细胞在脂肪细胞诱导培养基和维持培养基中进行交替诱导。（5）脂肪细胞样细胞的鉴定：通过油红O染色的方法对所述步骤（4）中获得的诱导细胞进行鉴定。所述步骤（1）中成纤维细胞为来源于动物的皮肤成纤维细胞。所述步骤（2）中诱导剂为鱼卵母细胞提取物，所使用的鱼为昆明产当地鲫鱼，优选卵黄充满时相时期的鲫鱼。所述步骤（3）中使用的鱼卵母细胞提取物终浓度为10~20μg/ml，成纤维细胞的诱导时间为72小时。所述步骤（4）中使用的脂肪细胞分化诱导培养基组份包括基础培养基、10%胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素、100mg/ml链霉素、10mg/L胰岛素、0.1mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1.0μmol/L地塞米松、0.1mmol/L吲哚美辛；维持培养基组份包括基础培养基、10%胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素、100mg/ml链霉素、10mg/L胰岛素。所述步骤（5）中判断诱导多能干细胞是否分化为脂肪细胞样细胞，即检测诱导多能干细胞经过定向培养后是否有脂肪细胞特异性脂滴生成，检测方法为油红O染色。油红O储存染液配置方法为：将0.7g油红O溶于200ml的异丙醇中，充分溶解后用0.22μm过滤器进行过滤，4℃条件避光储存备用。当进行油红O染色时，需要将油红O储存液配置成油红O工作液，油红O工作染液配置方法为：将油红O储存液与超纯水以3:2比例充分混合，0.22μm过滤器过滤后使用。本专利技术的实质性特点和显著进步在于，本专利技术提供了一种非转基因操作的、可获得安全性相对较好的脂肪细胞样细胞的方法，在人或其它非啮齿类动物脂肪组织代谢及调控等研究方面不再局限于使用基于小鼠的前体脂肪细胞系。本专利技术方法的另一显著特点在于本专利技术的方法实验操作相对简单，实验设备和技术要求不高，在脂肪组织代谢等研究领域具有广阔应用前景。附图说明图1是培养的人成纤维细胞。图2是重编程细胞Sox2、Nanog、Oct4/3表达免疫组化图。A为Sox2基因，B为Nanog，C为Oct4/3，D为对照组成纤维细胞。图3是诱导的脂肪细胞样细胞油红O染色图。图4是对照细胞油红O染色图。具体实施方式下面结合附图和实施例进一步说明本专利技术的技术方案。实施例仅为了便于更好理解本专利技术而不局限于本专利技术范围。实施例1。诱导剂的制备。本实施例诱导剂为鱼卵母细胞提取物，实验用鱼为鲫鱼，优选卵黄充满时相时期的鲫鱼，其制备方法为：（1）将用于鱼卵母细胞提取物制备的鲫鱼完全浸没于75％的酒精中浸泡15～20分钟；（2）在通风橱中以无菌的条件下取出鱼卵，然后置入预冷的研钵中，将研钵置于冰上进行充分研磨；（3）研磨完成后，加入预冷的生理盐水，4℃条件下1000rpm离心10min，然后4℃条件下3000rpm离心10min，取上清；（4）使用0.22微米孔滤器进行过滤，利用考马斯亮蓝法测定制备的鱼卵母细胞提取物的蛋白含量；（5）根据测得的蛋白浓度用预冷的DMEM/F12培养基稀释成10mg/ml，4℃保本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导成纤维细胞为脂肪细胞样细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）成纤维细胞的制备，包括成纤维细胞的分离、鉴定和培养；（2）诱导剂的制备，诱导成纤维细胞发生重编程的诱导剂为鱼卵母细胞提取物；（3）成纤维细胞的诱导，利用所述步骤（2）中制备的鱼卵母细胞提取物对所述步骤（1）中制备的成纤维细胞进行诱导，通过诱导，使成纤维细胞重编程为具有多向分化潜能的诱导多能干细胞；（4）诱导多能干细胞向脂肪细胞样细胞的分化，将所述步骤（3）中获得的诱导多能干细胞在脂肪细胞诱导培养基和维持培养基中进行交替诱导；（5）脂肪细胞样细胞的鉴定，通过油红O染色的方法对所述步骤（4）中获得的诱导细胞进行鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种诱导成纤维细胞为脂肪细胞样细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）成纤维细胞的制备，包括成纤维细胞的分离、鉴定和培养；（2）诱导剂的制备，诱导成纤维细胞发生重编程的诱导剂为鱼卵母细胞提取物；（3）成纤维细胞的诱导，利用所述步骤（2）中制备的鱼卵母细胞提取物对所述步骤（1）中制备的成纤维细胞进行诱导，通过诱导，使成纤维细胞重编程为具有多向分化潜能的诱导多能干细胞；（4）诱导多能干细胞向脂肪细胞样细胞的分化，将所述步骤（3）中获得的诱导多能干细胞在脂肪细胞诱导培养基和维持培养基中进行交替诱导；（5）脂肪细胞样细胞的鉴定，通过油红O染色的方法对所述步骤（4）中获得的诱导细胞进行鉴定。2.采用权利要求1所述一种诱导成纤维细胞为脂肪细胞样细胞的方法，其特征在于，所述步骤（3）中使用的鱼卵母细胞提取物终浓度为10~20μg/ml，成纤维细胞在添加鱼卵母细胞提取物的培养基中的诱导培养时间为72小时。3.采用权利要求1所述一种诱导成纤维细胞为脂肪细胞样细胞的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱向情，潘兴华，陈强，
申请(专利权)人：陈强，
类型：发明
国别省市：云南,53