Treg细胞与心肌成纤维细胞共培养时的互促增殖作用制造技术

本发明专利技术提供CD4

【技术实现步骤摘要】
Treg细胞与心肌成纤维细胞共培养时的互促增殖作用
本专利技术涉及CD4+CD25+Treg细胞与心肌成纤维细胞共培养时的互促增殖作用。
技术介绍
心肌纤维化，其主要表现以心肌正常组织结构中细胞增殖、细胞外基质过度沉积，是多种心脏疾病发展至一定阶段所共有的病理改变。心肌纤维化与高血压，心肌梗死，病毒性心肌炎，动脉粥样硬化等多种疾病的病理过程有着密切联系，同时也是慢性心衰进展过程中重要的病理表现，还可导致心律失常和心源性猝死等严重并发症，故预防和逆转心肌纤维化是临床治疗心力衰竭的关键点之一。心肌纤维化的发病机制至今尚未明确，有观点认为肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的过度激活是引起心肌纤维化的关键。调节性T细胞是免疫反应和炎症作用平衡中的关键因素之一。早在1995年，Sakaguchi就在研究中发现成年鼠中近10％的外周CD4+T细胞可表达IL-2受体α链CD25的信号表征，去除这群细胞会引起大鼠产生多种自身免疫性疾病，而再次回输该细胞就能阻止疾病的发生。因此将这群细胞命名为CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatoryTcells,Tregs)。在炎症反应中，机体免疫系统激活，免疫细胞可分泌大量的炎症因子，炎症因子可直接或间接引起或逆转心肌纤维化。目前被广泛认可的T细胞活化的信号通路调控为：Kv1.3通道维持T淋巴细胞的静息电位，使T细胞处于能被活化的状态；T淋巴细胞被活化后，KCa3.1通道作为钙离子激活的钾离子通道会使膜电位超极化，使得Ca2+持续内流，促使钙释放激活Ca2+(Ca2+-releaseactivatingCa2+，CRAC)通道打开，上调内质网的钙库释放Ca2+的量，Ca2+增加后可通过钙依赖性的蛋白激酶通路启动各种细胞因子的转录，使其发挥免疫效能。
技术实现思路
而本申请人通过实验，发现Tregs在心肌纤维化进程中的表现与
技术介绍
中所述并不相同，确切地说，得到了与现有技术相反的结论，即：正常大鼠CD4+CD25+Treg细胞与心肌成纤维细胞在体外共培养时，具有互促增殖作用；Tregs无法起到免疫效果，具有促心肌纤维化的作用。因此，本专利技术的第一个目的是提供CD4+CD25+Treg细胞与心肌成纤维细胞共培养时的互促增殖作用。作为优选，所述共培养为体外共培养。作为优选，共培养48h后，CFs细胞增殖达平稳期。作为优选，共培养后，Tregs时间依赖性地增加CFs的增殖；作为优选，所述时间依赖性是Tregs在0-48h内呈时间依赖性地增加CFs的增殖。作为优选，共培养后，Tregs促进CFs的I型胶原、III型胶原及基质金属蛋白2(MMP2)的分泌。作为优选，共培养后，CFs促进Tregs细胞内、外TGF-β和IL-10的分泌。作为优选，共培养后，Tregs细胞内TGF-β的增加明显高于IL-10的增加。作为优选，共培养后，CFs促进Tregs的Kv1.3、KCa3.1和CRAC三种离子通道mRNA的表达。作为优选，共培养后，CFs明显促进Tregs的Kv1.3通道mRNA的表达。作为优选，共培养后，CFs促进Tregs的Kv1.3通道的蛋白质表达。本专利技术的第二个目的是要求保护本申请提出的：CD4+CD25+Treg细胞具有促心肌纤维化的作用。本申请人通过正常成年SD大鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞(Tregs)体外与SD大鼠乳鼠心肌成纤维细胞(CFs)共培养，观察两种细胞的相互作用。具体方法为：免疫磁珠分选正常成年SD大鼠脾脏Tregs，差速贴壁法分选SD大鼠3日乳鼠的CFs，共培养一定时间后，CCK-8法检测各组CFs及Tregs增殖的相互影响，ELISA法检测CFs分泌的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白2(MMP2)及Tregs细胞内、外的TGF-β及IL-10的相对表达水平，RT-qPCR技术检测Tregs的Kv1.3、KCa3.1及CRAC通道mRNA的相对表达水平，In-cellwesternblotting(ICWB)法检测Tregs细胞的Kv1.3通道蛋白质的相对表达水平。本专利技术的实验结果为：两种细胞共培养48h后，CFs细胞增殖达平稳期，CFs与Tregs均明显相互促进增殖(P＜0.01)；CFs分泌的Ⅰ型、Ⅲ型胶原和MMP2的相对表达水平均明显增加(P＜0.01)。Tregs细胞内、外TGF-β和IL-10与共培养前相比均明显增加(P＜0.01)，但胞内的TGF-β的增加明显高于IL-10的增加(P＜0.01)，胞外两种因子增加无统计学差异；Tregs的Kv1.3、KCa3.1、CRAC通道mRNA的相对表达水平均明显增加(P＜0.01)；Tregs的Kv1.3通道蛋白质亦明显增加(P＜0.01)。本专利技术的实验结论为：体外Treg与CFs共培养48h后，Tregs明显促进CFs的增殖，CFs亦明显促进Tregs细胞活化及增殖。本专利技术为国家自然科学基金资助项目(编号：81360491)。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为共培养时，Tregs对CFs增殖影响的时间曲线；图2为共培养48h时，CFs及Tregs增殖的互相影响；其中，A为CFs的增殖改变，B为Tregs的增殖改变；图3为共培养48h后，Tregs促进CFs中I、III型胶原蛋白及MMP2的分泌；图4为共培养48h后，CFs对Tregs内、外TGF-β及IL-10分泌水平的影响；图5为共培养48h后，CFs对Tregs的三种离子通道mRNA的表达水平的影响；图6为共培养48h后，CFs对Tregs细胞膜Kv1.3通道蛋白表达的影响。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例11.材料与方法1.1实验材料1.1.1实验对象15周的雄性SD大鼠(新疆医科大学动物房)，体重控制在250～300g。刚出生的SD乳鼠，母鼠喂养3日。1.1.2主要试剂和仪器免疫磁珠分选器(德国美天旎)，BiotinMouseAnti-RatCD4(BD554836)，PE-Mouse-Anti-RatCD25(BD554866),大鼠淋巴细胞分离液(LTS1083，Sigma)，胎牛血清、RPMI1640培养液(Hyclone)，sybr试剂盒(Life)，小鼠抗大鼠KCNN1.3一抗ab105562(Abcam)，β-actinab8226(Abcam)，800CWGoatanti-mouse(LI-COR)等。1.2实验方法1.2.1Tregs的分选免疫磁珠分选法分选正常SD大鼠脾脏CD4+CD25+Tregs(详见相关试剂操作说明书)阳性分选得到Tregs，进行细胞计数及存活率的统计，用含10g/L牛血清，rmIL-2(10μL/mL)，TGF-β1(2.5×106IU/mL)，双抗(2μg/mL)，anti-CD3(10μL/mL)及HSP60(10μL/mL)的完全培养基于37℃5％CO2孵育48h待用，免疫磁珠分选法所得Tr本文档来自技高网...

【技术保护点】
CD4

【技术特征摘要】
1.CD4+CD25+Treg细胞与心肌成纤维细胞共培养时的互促增殖作用。2.根据权利要求1所述的互促增殖作用，其特征在于：所述共培养为体外共培养。3.根据权利要求1所述的互促增殖作用，其特征在于：共培养48h后，CFs细胞增殖达平稳期。4.根据权利要求1所述的互促增殖作用，其特征在于：共培养后，Tregs时间依赖性地增加CFs的增殖；作为优选，所述时间依赖性是Tregs在0-48h内呈时间依赖性地增加CFs的增殖。5.根据权利要求1所述的互促增殖作用，其特征在于：共培养后，Tregs促进CFs的I型胶原、III型胶原及基质金属蛋白2的分泌。6.根据权利要求1所述的互促增殖作用...

【专利技术属性】
技术研发人员：程路峰，徐琦，邵培培，李少华，刘长江，武洋，周勇，
申请(专利权)人：新疆医科大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65