嵌合抗原受体及其表达基因、光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种嵌合抗原受体及其表达基因、光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用。该嵌合抗原受体表达基因包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因。第一融合蛋白表达基因包括依次连接的抗原结合区域表达基因、铰链蛋白表达基因、第一跨膜蛋白表达基因和拟南芥隐花色素蛋白‑2表达基因。第二融合蛋白表达基因包括依次连接的第二跨膜蛋白表达基因、碱性螺旋环螺旋蛋白‑1表达基因和胞内信号传导蛋白表达基因。这种创新设计的嵌合抗原受体表达基因能够成功导入T细胞中形成嵌合抗原受体修饰的T细胞，在特定的蓝光条件和特定抗原条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少，特异性高。

【技术实现步骤摘要】
嵌合抗原受体及其表达基因、光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种嵌合抗原受体及其表达基因、光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用。
技术介绍
嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)是人工构建的融合基因编码的跨膜分子。一般包括胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。CAR-T，即嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞。CAR-T细胞应用于癌症治疗，显示了极佳疗效和巨大的潜力。如诺华于2015年12月5日在ASH会议上公布了其靶向CD19分子的CAR-T(CTL019)在治疗难治、复发急性淋巴性白血病(ALL)方面的2期临床数据，2期数据与2014年公布的1期数据相似，完全缓解率(CR)分布高达93％(55/59)和92％(36/39)。传统的CARs主要可以分为三代，如图1，第一代CARs通常使用一条信号链，称为“信号1”(signal1)。第一代CAR-T细胞在临床试验中表现出了有限的功效，这可能是由于移植T细胞激活诱导的细胞死亡(activation-inducedcelldeath，AICD)，或者缺乏长期的T细胞扩增。第二代CARs利用第一代CARs作为一种支柱，增加了一个额外的共刺激信号域，称为“信号2”；因此，相同的受体需传递“信号1”和“信号2”以优化T细胞的激活。第二代CAR-T与第一代CAR-T相比，回输到非霍奇金淋巴瘤患者中的持久性和扩增性增强了。但是究竟哪一种是最佳的第二信号还有待确定。另一个需要解决的问题是，当比较不同的CAR-T细胞设计时，是否持久性和/或扩增性的阈值对产生有效临床结果是必须的。第三代CARs的信号域包两个共刺激域，临床前研究表明，第三代CAR-T细胞比第二代CAR-T细胞具有更强的抗肿瘤效力。然而，CAR-T细胞应用于癌症治疗，在显示出疗效的同时，伴随有毒性和风险，甚至导致病人死亡。2016年9月26日，Kite公布了KTE-C19的II期临床数据的中期分析结果。治疗的完全缓解率达到了47％。然而，此次参与试验的62名患者中，有1/3患者产生了严重的神经毒性，18％的患者受到了细胞因子释放综合征的影响，2人死于KTE-C19相关的不良反应。其中，细胞因子释放综合症(cytokinesreleasesyndrome，CRS)是最显著的毒性，为头号安全风险。细胞因子释放综合症是基于T细胞的激活，是T细胞激活活性的一个反应，所以副作用是与CAR-T的治疗机制正相关的临床反应。高度增殖的T细胞能引起CRS，表现为高热和肌痛，不稳定的低血压和呼吸衰竭。这是一个意想不到的结果，因为在临床前动物模型中没有出现类似症状。从CRS观察中发现一个关键的点，除了预期的效应细胞因子INF-γ外，IL-6在CART治疗的细胞指数级增殖期间也会迅速提升。CRS可能直接与另一个毒性相关联，即巨噬细胞活化综合征。除了CRS，还存在由工程改造的T细胞的抗原特异性导致的“靶向”毒性。例如溶瘤综合征，它直接是由肿瘤细胞的裂解而导致的。当CARs靶向于B细胞表面表达的靶点如CD19时，会引起B细胞发育不良，这就是一个“靶向”毒性，但却错误的攻击了正常组织细胞的结果。只要CD19CAR-T细胞长时间存在，B细胞发育不良的情况就不会改善。B细胞发育不良与CD20特异性单抗治疗一样会造成严重的低丙种球蛋白血症，需要静脉注射免疫球蛋白。最近报告了输注改造的T细胞引发致命毒性的2个案例，有一例患者接受了HER2-CAR治疗，两例患者接受了靶向MAGE-A3的TCR-T细胞治疗。在这2个案例中，均是因为正常组织表达这些靶点，导致急性不可逆的心肺毒性。所有的靶向毒性均是由于改造的T细胞无法区别表达靶向抗原的正常细胞和肿瘤细胞所致。CAR-T治疗白血病会引起神经系统症状，具有神经毒性。几个研究小组报道，这些症状具有多样性但可自行消退，如谵妄、语言障碍、运动障碍、缄默症和癫痫发作。虽然与全身CRS的发生有些时间上的关联，当然也与CAR-T存在于脑脊液中相关。这些症状的机制与靶组织仍有待确认。另外，CAR-T细胞应用于癌症治疗还有潜在的风险，如输注活化的T细胞存在引起自身免疫性疾病的风险，输注同种异体T细胞存在抗宿主移植病的潜在风险。这可能会引起曾接受同种异体造血干细胞移植的患者的担心。综上，传统的嵌合抗原受体存在治疗副作用多、特异性差等问题。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种治疗副作用少、特异性高的嵌合抗原受体及其表达基因和应用。此外，还有必要提供一种光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用。一种嵌合抗原受体表达基因，包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因；所述第一融合蛋白表达基因包括依次连接的抗原结合区域表达基因、铰链蛋白表达基因、第一跨膜蛋白表达基因和拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因；所述第二融合蛋白表达基因包括依次连接的第二跨膜蛋白表达基因、碱性螺旋环螺旋蛋白-1表达基因和胞内信号传导蛋白表达基因。在一个实施方式中，还包括连接肽表达基因，所述连接肽表达基因一端与所述拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因连接，所述连接肽表达基因的另一端与所述第二跨膜蛋白表达基因连接。在一个实施方式中，所述抗原结合区域表达基因用于表达抗原结合区域，所述抗原结合区域选自肿瘤相关抗原结合区域和病毒相关抗原结合区域中的至少一种；及/或，所述铰链蛋白表达基因用于表达铰链蛋白，所述铰链蛋白包括CD8α；及/或，所述第一跨膜蛋白表达基因用于表达第一跨膜蛋白，所述第一跨膜蛋白包括依次连接的CD28TM-CD28-4-1BB区域；及/或，所述第二跨膜蛋白表达基因用于表达第二跨膜蛋白，所述第二跨膜蛋白包括依次连接的CD28-4-1BB区域；及/或，所述胞内信号传导蛋白表达基因用于表达胞内信号传导蛋白，所述胞内信号传导蛋白包括CD3ζ。在一个实施方式中，所述抗原结合区域表达基因包括：(a)、SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，(b)、与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，所述铰链蛋白表达基因包括：(a)、SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，(b)、与SEQIDNo.2所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，所述第一跨膜蛋白表达基因包括：(a)、SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，(b)、与SEQIDNo.3所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，所述拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因包括：(a)、SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，(b)、与SEQIDNo.4所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，所述第二跨膜蛋白表达基因包括：(a)、SEQIDNo.5所示的核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因；所述第一融合蛋白表达基因包括依次连接的抗原结合区域表达基因、铰链蛋白表达基因、第一跨膜蛋白表达基因和拟南芥隐花色素蛋白‑2表达基因；所述第二融合蛋白表达基因包括依次连接的第二跨膜蛋白表达基因、碱性螺旋环螺旋蛋白‑1表达基因和胞内信号传导蛋白表达基因。

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因；所述第一融合蛋白表达基因包括依次连接的抗原结合区域表达基因、铰链蛋白表达基因、第一跨膜蛋白表达基因和拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因；所述第二融合蛋白表达基因包括依次连接的第二跨膜蛋白表达基因、碱性螺旋环螺旋蛋白-1表达基因和胞内信号传导蛋白表达基因。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，还包括连接肽表达基因，所述连接肽表达基因一端与所述拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因连接，所述连接肽表达基因的另一端与所述第二跨膜蛋白表达基因连接。3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，所述抗原结合区域表达基因用于表达抗原结合区域，所述抗原结合区域选自肿瘤相关抗原结合区域和病毒相关抗原结合区域中的至少一种；及/或，所述铰链蛋白表达基因用于表达铰链蛋白，所述铰链蛋白包括CD8α；及/或，所述第一跨膜蛋白表达基因用于表达第一跨膜蛋白，所述第一跨膜蛋白包括依次连接的CD28TM-CD28-4-1BB区域；及/或，所述第二跨膜蛋白表达基因用于表达第二跨膜蛋白，所述第二跨膜蛋白包括依次连接的CD28-4-1BB区域；及/或，所述胞内信号传导蛋白表达基因用于表达胞内信号传导蛋白，所述胞内信号传导蛋白包括CD3ζ。4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，所述抗原结合区域表达基因包括：(a)、SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，(b)、与SEQIDNo.1所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，所述铰链蛋白表达基因包括：(a)、SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，(b)、与SEQIDNo.2所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，所述第一跨膜蛋白表达基因包括：(a)、SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，(b)、与SEQIDNo.3所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，所述拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因包括：(a)、SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，(b)、与SEQIDNo.4所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，所述第二跨膜蛋白表达基因包括：(a)、SEQIDNo.5所示的核苷酸序列，(b)、与SEQIDNo.5所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQIDNo.5所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，所述碱性螺旋环螺旋蛋白-1表达基因包括：(a)、SEQIDNo.6所示的核苷酸序列，(b)、与SEQIDNo.6所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQIDNo.6所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，所述胞内信号传导蛋白表达基因包括：(a)、SEQIDNo.7所示的核苷酸序列，(b)、与SEQIDNo.7所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQIDNo.7所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有如权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体表达基因。6.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括第一融合蛋白和第二融合蛋白；所述第一融合蛋白包括依次连接的抗原结合区域、铰链蛋白、第一跨膜蛋白和拟南芥隐花色素蛋白-2；所述第二融合蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄彪，陈雪梅，刘韬，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44