一种肉碱类化合物全同位素内标质谱定量方法技术

本发明专利技术公开了一种新的生物样本中肉碱类化合物全同位素质谱定量方法，该方法是指采用稳定性同位素标记的正丁醇试剂与肉碱类化合物标准品的酯化衍生产物为定量内标，以液相色谱‑串联四极杆质谱为检测手段的肉碱类化合物的全同位素内标定量法。本发明专利技术能够同时对所有肉碱类化合物进行定量分析，具有定性定量准确、高通量和花费低的优点，弥补了当前肉碱类化合物测试干扰大、定量不准确以及需要大量昂贵的氘标记的肉碱类化合物标准品等缺点。本发明专利技术可显著提高新生儿筛选、临床疑似代谢病诊断和科学研究等检测的准确度，具有重要应用价值。

A total isotope mass spectrometry method for quantitative determination of carnitine compounds

The invention discloses a method for the quantitative mass spectrometry isotope carnitine in biological samples of new compounds, the method refers to the esterification derivatives of n-butanol and carnitine compound reagent standard using stable isotope labeled as internal standard, the isotope internal standard quantitative method of carnitine compounds by liquid chromatography tandem four pole as the detection means of mass spectrometry. The invention can simultaneously for all compounds carnitine by quantitative analysis with qualitative and quantitative, accurate, high-throughput and low cost advantages, make up the current carnitine compounds interference, quantitative test is not accurate and the shortcomings of large carnitine deuterium labeled compounds of expensive standard etc.. The invention can significantly improve the accuracy of the screening of newborns, the diagnosis of clinical suspected metabolic diseases and scientific research, and has important application value.

【技术实现步骤摘要】
一种肉碱类化合物全同位素内标质谱定量方法
本专利技术涉及的是一种生物样本中肉碱类化合物的质谱定量检测分析方法，进一步说是一种生物样本中肉碱类化合物全同位素内标质谱定量方法。
技术介绍
L-肉碱(3-羟基-4-三甲基胺丁酸内盐)是一种广泛分布于人体各脏器中的来自于赖氨酸和蛋氨酸的生物合成产物，其中约25％在肝脏、肾脏和脑中合成，其余部分则来自于红肉和奶产品等。脂肪酸的彻底氧化必须在线粒体中进行，但是其本身无法进入线粒体。L-肉碱的主要作用是与脂肪酸或支链氨基酸的脱氨产物相结合形成酰基肉碱，将这些代谢物从细胞质运输到线粒体内，经β-氧化而彻底降解并产生能量。如果遗传性代谢缺陷患者体内参与脂肪酸和氨基酸代谢的代谢酶或转运蛋白发生异常，那么就会导致血浆中的肉碱和酰基肉碱浓度异常，因此，脂肪酸或支链氨基酸代谢紊乱会导致一个或多个酰基肉碱水平的特征性改变。典型的症状有：低酮血症、低血糖症、肝病、骨骼疾病和心肌炎。如果婴儿发生严重遗传性代谢缺陷并且没有得到及时合适的治疗的话，可能会导致突然死亡或严重的疾病。在青少年甚至成人阶段，这些代谢异常也可能出现尤其是当遇到环境压力发生显著变化时。肥胖和二型糖尿病的发生与脂代谢异常密切相关，最近一系列的人群研究和基础生命科学研究证实，血浆肉碱类化合物水平的异常是二型糖尿病的重要风险因子，是二型糖尿病的早期预测和诊断分型的候选标志物。在有机物的定量分析领域，电喷雾离子化结合串联质谱技术因其高灵敏度和高通量的优点而受到越来越多的青睐。该技术已经作为常规检测应用于新生儿筛查和疑似代谢病患者的诊断。目前广泛使用的L-肉碱和酰基肉碱化合物分析方法是先对肉碱类化合物及部分(稳定同位素标记的肉碱和酰基肉碱)内标进行正丁醇酯化衍生，案后采用三重四极杆质谱对这些丁酯化衍生物的不同母离子及其共有的子离子(m/z＝85)进行扫描并定量。但是，这种方法因缺少色谱分离而存在不能区分异构体、可能会出现交叉干扰(cross-talk)现象、严重的基质抑制效应以及衍生过程中酰基肉碱被部分水解成肉碱等缺点，因此定量不准确。最近几年，研究人员开发了几种HPLC-ESI-MS/MS的检测方法来克服以上提到的种种缺陷。在这些方法中，酰基肉碱或其衍生物在进入质谱之前先进行色谱分离，再进行MRM检测。如Hoppel博士研究组合成了一种新的衍生条件温和(不会造成酰基肉碱水解)的五氟苯甲酰三氟磺基甲烷，结合色谱分离以及多点标准曲线的制备可以对不同的脂酰肉碱包括异构体进行准确的定量分析。但是该方法需要合成衍生化试剂、预处理及分析时间太长并且需要用爆炸性试剂等，而在临床应用上受到限制。2012年Gucciardi等报道了一个15分钟内同时测定48种正丁醇衍生化的酰基肉碱的LC-MS/MS方法，一些重要的异构体以及一些已知的干扰物得到了完全分离。他们对LC-MS/MS方法和流动注射法进行了比较，发现只有乙酰肉碱具有可比性，而其他的酰基肉碱测定值之间都没有相关性。有文献研究发现，这种差异甚至达到几倍的差异。究其原因，是因为基质效应和干扰物的影响。而非衍生化酰基肉碱的LC-MS/MS方法虽然具有样品预处理大大简化、避免了样品衍生过程中水解的发生，但是灵敏度过低以及一些长链酰基肉碱CV值过大的现象导致该方法还难于应用。理论上，要做到对复杂生物样本中每个化合物均进行准确定量的最可靠方法就是以该物质的相应稳定性同位素标记物作为定量内标。但是，同位素内标价格极其昂贵或难于商业化购买，当前肉碱类化合物定量检测最多仅使用13种同位素内标，其它酰基肉碱则采用与其色谱保留时间或质荷比数相接近的同位素内标去估计定量。结果，很多酰基肉碱的定量与实际值相差甚远。因此，临床上肉碱和酰基肉碱结果需要根据各研究单位自己建立的参考值做出诊断。因为，这些检测都是半定量方法，方法间的检测差异很大，标准不统一，通用性差。综上所述，当前肉碱类化合物测定方法中均存在一些优点与缺点，方法的优劣主要在于灵敏度、特异性、定量准确度和易用性。采用化学衍生法可显著提高灵敏度。色谱分离则有助于提高特异性和定量准确度，样本制备的自动化或半自动化可提高准确度和易用性。但是，目前的方法均存在定量不准确这个共性问题，主要原因在于商业化可利用的同位素标记肉碱类化合物的缺乏。质谱定量最准确的方法是同位素内标定量法。但是，稳定性同位素标记的化合物价格昂贵，甚至无法商业化购买到，如目前仅仅有13种氘标记的肉碱类化合物作为内标。上述问题急待解决。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肉碱类化合物全同位素内标质谱定量方法，解决现有肉碱类化合物(L-肉碱和酰基肉碱)串联四极杆质谱定量检测分析方法存在的定量不准确性问题。为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供一种肉碱类化合物全同位素内标质谱定量方法，采用肉碱类化合物标准品与稳定性同位素标记的正丁醇的酯化衍生产物为定量内标，包括以下具体步骤：(1)肉碱类化合物的稳定性同位素标记正丁醇和非标记的正丁醇衍生物的制备：取肉碱类化合物的混合标准品甲醇溶液两份，氮气吹干，分别加入稳定性同位素标记正丁醇衍生试剂和正丁醇衍生试剂，加热衍生，氮气吹干,加入80％乙腈水溶液(体积比)复溶，分别得到肉碱类化合物的稳定同位素标记正丁醇酯化衍生产物(内标母液)和正丁醇酯化衍生产物，对该内标母液进一步稀释，获得基准内标溶液，作为生物样本的复溶溶剂。(2)质谱定性定量方法的建立：采用流动注射法分别对正丁醇酯化衍生产物和稳定性同位素标记的正丁醇酯化衍生产物进行电喷雾离子化质谱检测参数优化,建立非标记和稳定性同位素标记衍生物的MRM条件，该方法用于常规快速测试；在此基础上，将串联四极杆质谱与液相色谱仪联用，采用反相液相色谱柱对肉碱类化合物的正丁醇酯衍生物和/或稳定同位素标记正丁醇酯衍生物进行色谱分离，确定各物质的色谱保留时间，建立肉碱类化合物的定性检测条件，该方法将用于精确定量分析。(3)肉碱类化合物定量标准曲线的制备:对步骤(1)中获得的肉碱类化合物的同位素标记正丁醇酯化衍生产物进行梯度稀释(包含基准内标溶液的梯度)，采用建立的质谱定性定量方法进行检测定量，以进样浓度为横坐标，以测得的丰度(峰高或峰面积)与内标溶液浓度的丰度(峰高或峰面积)的比值为纵坐标，建立定量标准曲线。(4)生物样本的制备、检测和定量：取生物样本，采用甲醇沉淀蛋白和提取肉碱类化合物，冷冻离心取上清液，氮气吹干，加入50-200微升正丁醇衍生试剂，加热衍生，重新用氮气吹干衍生溶剂,加入50-200微升内标溶液进行复溶，冷冻离心，上清液用于检测，检测方法为步骤(2)建立和优化的方法，分别计算各个肉碱或酰基肉碱的正丁醇衍生物与其相应的稳定性同位素正丁醇衍生物内标的丰度比(峰高比或峰面积比)，代入定量标准曲线，计算得到样本中各肉碱及酰基肉碱含量。本专利技术的进一步改进在于：肉碱类化合物标准品是指天然或人工合成的非同位素标记的L-肉碱和酰基肉碱系列物质。本专利技术的进一步改进在于：稳定性同位素标记的正丁醇是指氘标记的正丁醇中任一种。本专利技术的进一步改进在于：氘标记的正丁醇是指含有3-10个氘原子的正丁醇本专利技术的进一步改进在于：稳定性同位素标记的正丁醇试剂具体指稳定性同位素标记正丁醇与乙酰氯(体积比为1:5至1:2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肉碱类化合物全同位素内标质谱定量方法，其特征在于，采用肉碱类化合物标准品与稳定性同位素标记的正丁醇的酯化衍生产物为定量内标，包括以下具体步骤：(1)肉碱类化合物的稳定性同位素标记正丁醇衍生物和非标记的正丁醇衍生物的制备：取肉碱类化合物的混合标准品母液甲醇溶液两份，氮气吹干，分别加入稳定性同位素标记正丁醇衍生试剂和正丁醇衍生试剂，加热衍生，氮气吹干,加入乙腈水溶液复溶，分别得到肉碱类化合物的稳定同位素标记正丁醇酯化衍生产物和正丁醇酯化衍生产物，得到的肉碱类化合物的稳定同位素标记正丁醇酯化衍生产物的溶液为内标母液，对该内标母液进一步稀释，获得基准内标溶液，作为生物样本的复溶溶剂。(2)质谱定性定量方法的建立：采用流动注射法分别对正丁醇酯化衍生产物和稳定性同位素标记的正丁醇酯化衍生产物进行电喷雾离子化质谱检测参数优化,建立非标记和稳定性同位素标记衍生物的MRM条件；并将串联四极杆质谱与液相色谱仪联用，采用反相液相色谱柱对肉碱类化合物的正丁醇酯衍生物和/或稳定同位素标记正丁醇酯衍生物进行色谱分离，确定各物质的色谱保留时间，建立肉碱类化合物的定性检测条件，该方法将用于精确定量分析。(3)肉碱类化合物定量标准曲线的制备:对步骤(1)获得的内标母液进行梯度稀释，其中包括基准内标溶液浓度；采用步骤(2)中建立的质谱定性定量方法进行检测定量，以进样浓度为横坐标，以测得的系列浓度的肉碱类化合物的同位素标记正丁醇酯与基准内标溶液浓度的丰度的比值为纵坐标，建立定量标准曲线。(4)生物样本的制备、检测和定量：取生物样本，采用甲醇沉淀蛋白和提取肉碱类化合物，冷冻离心取上清液，氮气吹干，加入正丁醇衍生试剂，加热衍生，重新用氮气吹干衍生溶剂,加入基准内标溶液进行复溶，离心，上清液用于检测，检测方法为步骤(2)建立和优化的方法，分别计算各个肉碱或酰基肉碱的正丁醇衍生物与其相应的基准内标溶液浓度的丰度比，代入定量标准曲线，计算得到样本中各肉碱及酰基肉碱含量。...

【技术特征摘要】
1.一种肉碱类化合物全同位素内标质谱定量方法，其特征在于，采用肉碱类化合物标准品与稳定性同位素标记的正丁醇的酯化衍生产物为定量内标，包括以下具体步骤：(1)肉碱类化合物的稳定性同位素标记正丁醇衍生物和非标记的正丁醇衍生物的制备：取肉碱类化合物的混合标准品母液甲醇溶液两份，氮气吹干，分别加入稳定性同位素标记正丁醇衍生试剂和正丁醇衍生试剂，加热衍生，氮气吹干,加入乙腈水溶液复溶，分别得到肉碱类化合物的稳定同位素标记正丁醇酯化衍生产物和正丁醇酯化衍生产物，得到的肉碱类化合物的稳定同位素标记正丁醇酯化衍生产物的溶液为内标母液，对该内标母液进一步稀释，获得基准内标溶液，作为生物样本的复溶溶剂。(2)质谱定性定量方法的建立：采用流动注射法分别对正丁醇酯化衍生产物和稳定性同位素标记的正丁醇酯化衍生产物进行电喷雾离子化质谱检测参数优化,建立非标记和稳定性同位素标记衍生物的MRM条件；并将串联四极杆质谱与液相色谱仪联用，采用反相液相色谱柱对肉碱类化合物的正丁醇酯衍生物和/或稳定同位素标记正丁醇酯衍生物进行色谱分离，确定各物质的色谱保留时间，建立肉碱类化合物的定性检测条件，该方法将用于精确定量分析。(3)肉碱类化合物定量标准曲线的制备:对步骤(1)获得的内标母液进行梯度稀释，其中包括基准内标溶液浓度；采用步骤(2)中建立的质谱定性定量方法进行检测定量，以进样浓度为横坐标，以测得的系列浓度的肉碱类化合物的同位素标记正丁醇酯与基准内标溶液浓度的丰度的比值为纵坐标，建立定量标准曲线。(4)生物样本的制备、检测和定量：取生物样本，采用甲醇沉淀蛋白和提取肉碱类化合物，冷冻离心取上清液，氮气吹干，加入正丁醇衍生试剂，加热衍生，重新用氮气吹干衍生溶剂,加入基准内标溶液进行复溶，离心，上清液用于检测，检测方法为步骤(2)建立和优化的方法，分别计算各个肉碱或酰基肉碱的正丁醇衍生物与其相应的基准内标溶液浓度的丰度比，代入定量标准曲线，计算得到样本...

【专利技术属性】
技术研发人员：占同文，
申请(专利权)人：上海谱领生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31