牛源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法技术

本发明专利技术公开了牛源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法，该阳性标准分子为能够自主复制的质粒分子，所述质粒分子中包含牛18SrRNA基因序列和牛线粒体COXI基因序列。本发明专利技术制备得到的牛源性成分PCR检测用阳性标准分子，具有制备过程简单、可长时间保存、特异性强以及灵敏度高的优势，该阳性标准分子不需要依赖标准牛材料的供应，可以替代牛基因组DNA用于牛成分的PCR定性、定量测量及分析，保证实验检测结果的可靠性，解决了食品监管工作中缺乏阳性对照的难题。

Positive standard molecules, preparation and detection methods for PCR detection of bovine derived components

The invention discloses a positive standard molecule, preparation and detection method for bovine derivedmaterials PCR detection, the positive standard for the autonomously replicating plasmid molecules, including gene sequence and bovine mitochondrial COXI gene plasmid in the bovine 18SrRNA. Positive standard molecules with bovine derivedmaterials detection PCR prepared by the invention has the advantages of the preparation process is simple and can be preserved for a long time, strong specificity and high sensitivity, the positive standard molecule does not need to rely on the standard bovine material supply, PCR qualitative and quantitative measurement and analysis can be used to replace the bovine genome DNA bovine components, ensure the reliability of test results, to solve the problem of lacking food supervision in positive control.

【技术实现步骤摘要】
牛源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法
本专利技术属于生物工程领域，尤其涉及一种牛源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法。
技术介绍
准确检测出食品中相应动物源成分的含量，是防治劣质肉制品流入市场的关键措施。荧光定量聚合酶链式反应(real-timeFluorescentQuantitativePolymeraseChainReaction，FQ-PCR)方法是聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)技术的一种，是公认的目前核酸检测的最常用定量检测方法。实时荧光定量PCR技术在PCR反应体系中加入能特异标记PCR产物的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对样品进行定量分析，实现了PCR技术由定性到定量的飞跃。由于使用FQ-PCR技术对样品进行检测时需要阳性参考物质作为对照，方可保证实验结果的可靠性。而现阶段，对于动物源性成分的检测过程中所用的阳性参考物质通常是动物基因组DNA。其中，牛成分检测过程中，提取牛基因组DNA过程复杂，制备非常不方便。由于牛基因组DNA的稳定性不能满足长期贮存及经常性使用的需要，因此，每次进行牛成分检测时，都需要重新制备牛基因组DNA作为阳性参考物质，影响牛成分测量的稳定性。
技术实现思路
本专利技术提供了牛源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法，以解决PCR检测过程中阳性参考物质制备复杂、储存困难的问题。第一方面，本专利技术提供了一种牛源性成分PCR检测用阳性标准分子，所述阳性标准分子为能够自主复制的质粒分子，所述质粒分子中包含牛18SrRNA基因序列和牛线粒体COXI基因序列。第二方面，本专利技术还提供了一种用以制备第一方面所述阳性标准分子的制备方法，包括以下步骤：（1）分别设计牛18SrRNA基因序列的扩增引物18S-F、18S-R和牛线粒体COXI基因序列的扩增引物BCOXI-F、BCOXI-R；牛18SrRNA基因序列的扩增引物18S-F、18S-R为：18S-F：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3'；18S-R：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'；牛线粒体COXI基因序列的扩增引物BCOXI-F、BCOXI-R为：BCOXI-F：5'-ACACTTAGCAGGAGTTTCCTC-3'；BCOXI-R：5'-TGATATAGAATAGGGTCTCCTCC-3'；（2）以牛基因组为模板基因组，用牛18SrRNA基因序列的扩增引物和牛线粒体COXI基因序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到牛18SrRNA基因序列和牛线粒体COXI基因序列；（3）将所述牛18SrRNA基因序列和牛线粒体COXI基因序列分别连接至pMD18-T载体，得到牛18SrRNA重组子和牛线粒体COXI重组子；（4）将所述牛18SrRNA重组子和牛线粒体COXI重组子通过限制性内切酶酶切并拼接，得到阳性标准分子。可选地，所述限制性内切酶为SalI酶和PstI酶。可选地，步骤（2）中，所述PCR扩增的反应体系为10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，模板基因组3μL，Taq酶12.5μL，加ddH2O调整反应体系的体积为25μL；所述PCR扩增的反应条件为94℃变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行40次循环，得到PCR产物；将所述PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，目的产物用胶回收试剂盒纯化，得到PCR纯化产物，即为牛18SrRNA基因序列和牛线粒体COXI基因序列。可选地，步骤（3）中，将所述牛18SrRNA基因序列和牛线粒体COXI基因序列分别与pMD18-T载体进行连接，4℃下过夜连接，得到牛18SrRNA重组子18S-pMD18-T和牛线粒体COXI重组子BCOXI-pMD18-T。可选地，步骤（4）中，将所述牛18SrRNA重组子和牛线粒体COXI重组子分别用SalI酶和PstI酶进行双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，将回收片段连接，4度过夜连接，摇床均匀混匀2小时进行质粒转化，得到转化质粒；将所述转化质粒进行凝胶电泳分离，回收大分子质粒条带进行重组克隆质粒筛选回收，得到重组克隆；将所述重组克隆通过常规PCR验证、SalI和PstI的酶切验证及酶切产物测序验证，得到的质粒分子18S-BCOXI-pMD18-T即为阳性标准分子。第三方面，本专利技术还提供了一种用以检测第一方面所述阳性标准分子特异性的检测方法，具体地，利用特异性检测引物和探针，以所述阳性标准分子为模板进行实时荧光PCR反应，所述特异性检测引物和探针包括以下两组：牛18SrRNA基因序列的特异性检测引物18S-F、18S-R和探针18S-P：18S-F：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3'；18S-R：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'；18S-P：5'-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3'牛线粒体COXI基因序列的特异性检测引物BCOXI-F、BCOXI-R和探针BCOXI-P：BCOXI-F：5'-ACACTTAGCAGGAGTTTCCTC-3'；BCOXI-R：5'-TGATATAGAATAGGGTCTCCTCC-3'；BCOXI-P：5'-ACCAAACCCCTCTGTTCGTATGATCCG-3'。可选地，所述探针的5'端修饰有荧光报告基团，3'端修饰有荧光淬灭基团。本专利技术制备得到的牛源性成分PCR检测用阳性标准分子，具有制备过程简单、可长时间保存、特异性强以及灵敏度高的优势，该阳性标准分子不需要依赖标准牛材料的供应，可以替代牛基因组DNA用于牛成分的PCR定性、定量测量及分析，保证实验检测结果的可靠性，解决了食品监管工作中缺乏阳性对照的难题。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本专利技术。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术制备的阳性标准分子的结构示意图；图2为牛18SrRNA基因序列实时荧光PCR扩增曲线对比图；图3为牛线粒体COX1基因序列实时荧光PCR扩增曲线对比图；图4为本专利技术制备的阳性标准分子的灵敏度检测结果图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例一1、DNA提取：采用QIAGENDNeasyBloodandTissueKit提取牛肉基因组DNA，用分光光度计检测DNA纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8-1.9左右，浓度在10ng/μL以上，说明DNA纯度较高，浓度适中，符合PCR扩增要求。2、引物及特异性探针设计：对GeneBank中搜索牛18SrRNA基因序列和牛线粒体COXI基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛源性成分PCR检测用阳性标准分子，其特征在于，所述阳性标准分子为能够自主复制的质粒分子，所述质粒分子中包含牛18SrRNA基因序列和牛线粒体COXI基因序列。

【技术特征摘要】
1.一种牛源性成分PCR检测用阳性标准分子，其特征在于，所述阳性标准分子为能够自主复制的质粒分子，所述质粒分子中包含牛18SrRNA基因序列和牛线粒体COXI基因序列。2.一种如权利要求1所述的阳性标准分子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：（1）分别设计牛18SrRNA基因序列的扩增引物18S-F、18S-R和牛线粒体COXI基因序列的扩增引物BCOXI-F、BCOXI-R；牛18SrRNA基因序列的扩增引物18S-F、18S-R为：18S-F：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3'；18S-R：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'；牛线粒体COXI基因序列的扩增引物BCOXI-F、BCOXI-R为：BCOXI-F：5'-ACACTTAGCAGGAGTTTCCTC-3'；BCOXI-R：5'-TGATATAGAATAGGGTCTCCTCC-3'；（2）以牛基因组为模板基因组，用牛18SrRNA基因序列的扩增引物和牛线粒体COXI基因序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到牛18SrRNA基因序列和牛线粒体COXI基因序列；（3）将所述牛18SrRNA基因序列和牛线粒体COXI基因序列分别连接至pMD18-T载体，得到牛18SrRNA重组子和牛线粒体COXI重组子；（4）将所述牛18SrRNA重组子和牛线粒体COXI重组子通过限制性内切酶酶切并拼接，得到阳性标准分子。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述限制性内切酶为SalI酶和PstI酶。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR扩增的反应体系为10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，模板基因组3μL，Taq酶12.5μL，加ddH2O调整反应体系的体积为25μL；所述PCR扩增的反应条件为94℃变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行40次循环，得到PCR产物；将所述PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，目的产物用胶回收试剂盒纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑世超，孟静，任易婕，孙潇慧，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37