本发明专利技术公开了在饲料成中牛（Bostaurus）成分的核酸快速检测试剂盒的制备方法及其应用方法，属于分子生物学和免疫学领域。本发明专利技术将核酸检测中的聚合酶链式反应的高灵敏度、高特异性方法与免疫学检测中的免疫胶体金快速检测技术相结合，通过设计独特的引物，并对引物进行标记，对提取的靶DNA进行特异性扩增以及扩增产物在展开液中与试纸条上固定的金标记抗体结合而形成稳定、可见的检测带及质控带，从而实现对食品及饲料中牛源成分快速、准确的检测。
【技术实现步骤摘要】
一种食品及饲料中牛源成分检测侧向流试纸条检测试剂盒及其应用
本专利技术属于分子生物学和免疫学领域，食品及饲料中牛源DNA的PCR核酸扩增以及侧向流免疫胶体金试纸条试剂盒的制备和应用方法。
技术介绍
为防止牛海绵状脑病(bovinespongiformencephalopathy,BSE)经添加在动物饲料中的牛肉、牛骨传播，1994年欧盟和1997年美国分别在1994年和1997年制定禁止在反刍动物的饲料中添加反刍动物源性蛋白的法规，2000年欧盟将这项禁令扩大到禁止向用于食用的动物饲喂加工过的哺乳动物、鸟类和鱼类蛋白成分。我国农业部于2004年颁布的《动物源性饲料产品安全卫生管理办法》中规定禁止在反刍动物饲料中使用动物源性饲料产品(乳及乳制品除外)，但在动物饲料中人为掺入反刍动物(主要是牛、羊)肉和骨制品的现象时有发生。近年来，国内外食品市场上假羊肉、假牛肉等以假乱真现象层出不穷，动物源性食品掺杂掺假等各种食品安全事件的频发越来越让老百姓心惊胆颤。2013年初，欧洲的“马肉风波”愈演愈烈，使得消费者“闻马色变”。之后欧美的“鱼肉风波”又再一次拉响了食品安全的警钟。要保证食品及饲料的安全，需要灵敏、便捷、准确的检测方法提供基础。传统的饲料中动物性成分鉴定主要通过显微镜检、基于蛋白质检测的免疫学方法以及基于核酸检测的各类PCR方法，近年还发展了近红外检测法(NIRS)。饲料成分中掺入的各种动物源成分在高温处理和加工过程中易于受到破坏，不同种属动物的蛋白质序列之间差异不大，难以区别，专利技术专利“SDS-PAGE法鉴别肉及肉制品中动物源性成份”(公开号：CN102213720A)提供了一种以蛋白质的SDS-PAGE电泳方式鉴定猪、牛、羊、鸡、鱼的动物蛋白的方法，但不同来源和处理方式的蛋白电泳谱带不同，带来结果判别的障碍，对于饲料中的动物成分更难以实施。因为基因编码序列的简并性特征和非编码序列的存在，核酸成为较蛋白更易检出差异的靶分子，特别是线粒体DNA，拷贝数高，存在物种间差异，对其差异片段的分析是主要的鉴定方法，这类方法因灵敏度高，特异性好，耗时少而发展迅速，主要的方法包括普通/荧光PCR方法及基因芯片技术。在以线粒体DNA序列进行物种的种属鉴别时，常用的区域包括编码细胞色素B的Cytochromeb基因(cytB)、核糖体小亚基12SRNA编码序列(12SribosomalRNA)、细胞色素C亚基I(cytochromeCoxidasesubunitI)的编码基因coxI、编码ATP8及ATP6的atp8及atp6基因以及控制区D-loop片段。这些区域的序列变异适中，即在种内有一定的保守性，又体现出一定的中间差异。荧光定量PCR技术是一种高灵敏度核酸检测和定量方法，基本原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。荧光定量PCR技术使定性检测迈上了可以量化的台阶，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性，具有实时性和准确性等特点，特别是依赖探针结合的TaqMan方法，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。在物种鉴定应用方面，国内已经发布的国家标准或行业标准涵盖了牛、羊、鹿、骆驼、马、驴、猪、兔、狗和鱼等哺乳动物或水生生物。鉴于反刍动物的重要性，专利技术专利“鉴别反刍动物源性成分的荧光PCR检测试剂及制备方法和应用”(公开号：CN101659996A)描述了一种能同时鉴别牛、羊和山羊的荧光PCR方法，以三条探针进行动物来源甄别，公开号为CN102311999A的专利技术专利“驴或驴源性成分实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针”提供了以特定探针鉴别驴来源成分的荧光PCR方法，而公开号为CN102311998A的专利技术专利“马或马源性成分实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针”则提供了一种鉴定马来源成分的荧光PCR方法。公开号为CN101196463的专利技术专利“一种动物源性成分的鉴别方法”提供了一组可以鉴别牛、羊、猪、马、鸡等脊椎动物的引物序列和常规PCR-凝胶电泳方法，类似的，在禽类动物源鉴定方面，专利技术专利“一对鹅源性成分PCR检测用引物”(公开号：CN102337337A)描述了一种以常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳进行鉴定的方法，公开号为CN101270392A专利技术专利“PCR-mtDNA检测总禽源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法”则进一步提供了以一对引物检测多种禽类来源线粒体DNA的方法，上述方法中，实时定量PCR检测对设备依赖性强，难以实现现场检测，常规的PCR扩增检测需要对产物凝胶电泳后进行图像采集和分析，耗费时间较长，且难以保证检测的灵敏度。通过将免疫学检测的方法移植于核酸产物检测可以有效提高核酸产物的检测效率。通过将PCR扩增使用的引物标记特定的蛋白质或化合物可以在其扩增产物中引入同时包括两种化合物/蛋白质标记的核酸复合物，这个标记的产物可以通过抗体或者配体以类似双抗体夹心的方式进行检测，这个过程类似常规的免疫金标记检测技术，这种方法已经在单核苷酸多态性以及恒温扩增靶基因的方法中使用，特别是对病原微生物或疾病关联基因的鉴定，公开号为CN102134596A的专利技术专利-“一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法”即以此方法进行单核苷酸多态性的检测。而公开号为CN102520172A的专利技术专利“-单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用”描述了一种分别采用生物素和地高辛标记引物的牛基因组检测方法。因此类方法仅对扩增产物的有无进行判断，不对产物的分子量确认，因此在扩增反应中的干扰因素更多一些，常见的引起假阳性的原因包括：非特异性扩增、引物二聚体、扩增产物间的异常复性，解决引物二聚体、异常退火造成的干扰可以从PCR聚合酶的选择、引物序列优化、dNTP底物、杂交过程的控制几个方面开展。选择具有热启动(Hot-start)功能的DNA聚合酶可以明显降低引物二聚体和非特异扩增产物的形成。在引物优化方面，公开号为CN102146432A的专利技术专利-“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”描述了一种在引物5′端带有短回文序列的引物设计方法，该引物常温下自身环化，避免形成异源二聚体，公开号为CN102719547A的专利技术专利-“检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂”也采用了类似的方法用于实时定量PCR的扩增；公开号为CN101842494A的专利技术专利-“使用嵌合引物降低异源二聚体形成”描述了一种使用嵌合引物进行扩增的方法；在对反应底物的优化中，公开号CN101171343A的专利技术专利“含有假异胞嘧啶核酸碱基衍生物的3′修饰寡核苷酸及其作为引物或探针的应用”提供了一种使用特别修饰的核苷酸作为底物以减少引物二聚体形成的方法，使用探针或者引入内控探针也可以降低非特异扩增的干扰，公开号为CN101957373A的专利技术专利-“一种加入内控核酸对病原体核酸进行半定量检测的方法”即采用内控探针来降低干扰，上述方法中，使用热启动技术和环化引物是通行的方法，其余方法或者采用了特殊合成的底物及底物，或者需要通过探针引入第二次杂交过程，都会增加检测过程本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种食品及饲料中牛源成分的PCR-免疫胶体金试纸条检测方法，PCR使用的上游引物为：5’-GCCATATACTCTCCTTGGTGAC-3’，下游引物为：5’-TAGTAGGCTTGGGAATAGTACG-3’，选择生物素分子Biotin、异硫氰酸荧光素FITC或地高辛Digoxin中两种不同的标记对引物的5′端分别进行标记以便于检测，且上下游引物的标记不同；PCR的扩增条件为：95℃预变性5min，94℃变性30se...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑文杰，贺艳，陈其勇，程瑜，张宏伟，张灿，奚文辉，杜敬，韩宇宁，尹长城，刘斯奇，李宏虹，张亚莲，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：
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