用于膀胱癌检测的尿标记物制造技术

肿瘤的早期诊断是决定患肿瘤的患者的存活率的一个主要因素，所述肿瘤包括膀胱肿瘤。BTM或UBTM家族成员可在膀胱肿瘤组织和其它肿瘤组织中高度或持续地累积，和/或可在患者尿中累积，且因此可用作膀胱癌和其它类型癌症的标记物。在某些实施方案中，BTM或UBTM可在尿中累积，对UBTM家族成员进行检测可作为一种有效的诊断方法。在一些实施方案中，定量PCR方法优于微阵列方法。在其它实施方案中，对多种BTM或UBTM进行检测和定量可提高膀胱癌检测的敏感性和特异性，且因此提供了用于确定膀胱癌阶段和类型的方法。试剂盒提供了实施本发明专利技术方法的简易、便捷的途径。

Urinary markers for the detection of bladder cancer

Early diagnosis of cancer is a major factor in determining the survival rate of patients with tumors, including bladder tumors. BTM or UBTM family members can accumulate in bladder tumor tissues and other tumor tissues highly or persistently, and / or can accumulate in patient urine, and therefore can be used as markers for bladder cancer and other types of cancer. In some embodiments, BTM or UBTM can accumulate in urine, and detection of UBTM family members can be used as an effective diagnostic method. In some implementation schemes, quantitative PCR is better than microarray method. In other embodiments, detection and quantification of multiple BTM or UBTM can improve the sensitivity and specificity of bladder cancer detection, and thus provide a method for determining the stage and type of bladder cancer. The kit provides a simple and convenient way to implement the method of the invention.

【技术实现步骤摘要】
用于膀胱癌检测的尿标记物本申请是中国专利申请200580031939.3的分案申请，原申请的申请日是2005年7月22日，专利技术名称是“用于膀胱癌检测的尿标记物”。优先权要求本专利申请要求以下专利申请的优先权：新西兰临时专利申请号534,289(于2004年7月23日申请的“用于膀胱癌检测的标记物”，申请人：太平洋Edge生物科技公司(PacificEdgeBiotechnologyLtd.))；新西兰临时专利申请号539,219(于2005年4月4日申请的“用于膀胱癌检测的标记物”，申请人：太平洋Edge生物科技有限公司(PacificEdgeBiotechnologyLtd.))；以及美国临时专利申请号60/692,619(于2005年6月20日申请的“用于膀胱癌检测的尿标记物”，专利技术人：ParryJohnGuilford、NatalieJaneKerr和RobertPollock)。以上的每一申请均全部在此引入作为参考。专利
本专利技术涉及癌症检测。具体地，本专利技术涉及应用标记物进行膀胱癌检测。更具体地，本专利技术涉及应用尿标记物进行膀胱癌检测。而更具体地，本专利技术涉及应用尿中的寡核苷酸、蛋白质和/或抗体标记物对膀胱癌进行检测、分型和分期。专利技术背景介绍对癌症进行早期治疗时，癌症患者的存活率可大为提高。在膀胱癌的情况下，在疾病早期诊断出的患者的5年存活率大于90％，而与之相比在疾病晚期诊断出的患者其5年存活率约为15-30％。因此，导致膀胱癌早期诊断的进展可改进患者的预后。已建立的应用尿标本进行膀胱癌检测的方法为细胞学方法。但是，已知细胞学方法仅对约75％的浸润性膀胱癌的检测敏感，且仅对约25％的浅表性膀胱癌的检测敏感(Lotan和Roehrborn,泌尿学(Urology)61,109-118(2003))。广义上将膀胱癌分为两类，浸润性和浅表性。浸润性类型渗入到下面的组织层，而浅表类型趋向于主要以息肉样生长于膀胱内腔中。对尿中特异癌标记物进行鉴定可提供用于癌症早期诊断并导致早期治疗和预后改进的有益方法。特异癌标记物也可提供用于监控疾病进程并保证所监控的外科、放疗和化疗治疗的功效的方法。但是，对多种主要癌症而言，可用的标记物的缺点在于敏感性和特异性不足。目前，用于膀胱癌检测的最可靠的方法为膀胱镜检查联合以受损部位的活组织切片检查。但是，该技术费时、为侵入性且其敏感性仅为约90％，这意味着约10％的癌症患者不能用这些方法得以检测。非侵入性方法中的尿细胞学方法，可通过显微镜检测片状脱落的恶性细胞，为目前的优选方法。尽管细胞学方法的特异性约为95％，但其对低度损伤的敏感性很低(9-25％)，非常依赖样本质量且受到观测者间的高度差异的影响。最近，已尝试对膀胱活组织标本中的遗传标记物进行检测。最常用的方法为微阵列分析，方法中将含有与推断的遗传标记的部分互补的寡核苷酸的阵列，与获自患者样本的mRNA或cDNA样本进行接触。用这些方法，一些近期的报告已鉴定出多种推测的膀胱癌标记物。但是，阵列技术相对而言为非定量性且变异较大。对可指示膀胱癌存在的血液或尿标记物进行检测提供了用于改进该疾病检测的一种潜在方法。尽管膀胱癌血液标记物的研发进展缓慢，但已获得几种尿蛋白质标记物。对这些标记物的试验显示出优于细胞学方法的敏感性，但其特异性并非最佳，这是由于也通常可在患非恶性肿瘤疾病的患者中观测到这些标记物的水平提高，所述非恶性肿瘤疾病包括炎症、尿结石病和良性前列腺增生。例如，检测特异核基质蛋白的NMP22，其敏感性为47-87％且其特异性为58-91％。NMP22的高变异性意味着其并非为用于膀胱癌的快速、简易检测的理想方法。其它的尿试验包括基因转录物的RT-PCR扩增，所述基因转录物如来自尿样本细胞沉淀中的端粒酶hTERT。RT-PCR试验提供了潜在的高敏感性，但其对已存在的RT-PCR标记物的特异性仍然未知。需要用于癌症早期检测和诊断的其它方法。本专利技术提供了基于癌症标记物，特别是基于膀胱癌标记物的其它方法、组合物、试剂盒和设备，以助于癌症的早期检测和诊断。专利技术概述联合应用微阵列分析和定量聚合酶链反应(qPCR)，我们已经能够鉴定出选择用于膀胱癌的特异遗传标记物。在一些实施方案中，我们已经发现可用于膀胱肿瘤分期的标记物，且在其它实施方案中，我们已经鉴定出可区分肿瘤类型的标记物。在其它实施方案中，我们出乎预料地发现，两种或多种标记物的组合可提供用于膀胱癌检测的高度可靠和敏感的方法。而在进一步的实施方案中，我们已鉴定出在膀胱癌细胞中但不在血细胞中高度表达的标记物。因此，在许多实施方案中，膀胱癌试验出乎预料地优于现有技术中的试验。在某些实施方案中，应用微阵列分析来鉴定与非恶性膀胱组织相比在膀胱肿瘤组织中高度表达的基因。这些基因以及这些基因所编码的蛋白质，在此称为膀胱肿瘤标记物(BTM)。应当理解术语BTM并不需要标记物仅对膀胱肿瘤特异。确切地说，BTM表达的提高也可见于其它类型的肿瘤，包括恶性肿瘤。也应当理解BTM包括在血细胞中不高度表达的标记物。借助于来自尿的取样，并不存在于现有技术的活组织样本中通常存在的在其它细胞类型中的表达。术语BTM也包括用于膀胱癌检测的单独标记物的组合。在其它实施方案中，提供了鉴定样本中存在标记物的方法，包括免疫组织化学和定量聚合酶链反应(qPCR)。qPCR方法不易于产生在微阵列方法中常见的假象。此类假象包括置于阵列点上的寡核苷酸配体的数量差异、染料与阵列点上已杂交寡核苷酸的不均一和非预测性结合、非特异物质从阵列点上的不均一洗涤以及其它问题。在此公开的某些基因所编码的蛋白质由细胞分泌、从细胞切割或在细胞死亡时从细胞中释放。这些mRNA转录物及其蛋白质具有额外的用途，如用作膀胱癌的诊断标记物或用作监控已确认疾病进程的标记物。这些标记物可单独应用或彼此联合应用。此外，也可将保留在细胞内或与细胞关联的其它基因、RNA转录物及编码的蛋白质单独或彼此联合应用，以作为尿标记物。浅表性和浸润性膀胱癌的治疗策略可有所不同。浸润性膀胱癌需要更为紧急的外科切除，且其允许的治疗选择要少于浅表性膀胱癌。与之相反，浅表性膀胱癌可应用膀胱腔内化疗或膀胱腔内BCG免疫疗法成功地进行治疗。但目前，还没有不需进行膀胱镜检查即可简易且可靠地区分浅表性和浸润性膀胱癌类别的方法。应用如尿试验的非侵入性方法来区分这些类别的能力将允许临床医生选择适宜的治疗方案，而无需依赖昂贵、繁琐且通常患者不易接受的膀胱镜检查。我们已经出乎意料地发现，某些尿标记物，特别是不在血液中高水平存在的标记物，当联合或单独应用这些标记物时可对膀胱癌进行高度可靠、敏感且特异的诊断。附图简述本专利技术的描述参考其中的特定实施方案以及附图，其中：图1显示的表格描述了用于qPCR分析中的样本数和来源。图2显示的表格描述了用于本专利技术膀胱癌的qPCR分析的标记物和标记物的寡核苷酸探针。图3显示了应用微阵列方法从浸润性膀胱癌样本中鉴定出的BTM列表。图4显示了应用微阵列方法从浅表性膀胱癌样本中鉴定出的BTM列表。图5显示了应用定量PCR对特定BTM进行分析的研究中获得的结果列表。图6a-6af描述的柱状图显示了相对频率对Log2倍数改变数据，所述数据获自浸润性和浅表性膀胱肿瘤的多种本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于膀胱癌检测的方法，其包括：检测尿中UBTM家族成员的累积。

【技术特征摘要】
2004.07.23 NZ 534,289;2005.04.04 NZ 539,219;2005.01.用于膀胱癌检测的方法，其包括：检测尿中UBTM家族成员的累积。2.权利要求1的方法，其中所述UBTM家族成员并不以显著程度与血液相关联。3.根据权利要求1或2的方法，其中UBTM选自图3或图4中所示的组。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述检测步骤通过检测BTM或UBTMmRNA的累积而实施。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述检测应用微阵列实施。6.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述检测通过应用定量聚合酶链反应或杂交方法而实施。7.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述检测步骤通过检测UBTM蛋白质的累积而实施。8.权利要求7的方法，其中所述检测步骤通过检测UBTM肽的累积而实施。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述检测步骤通过应用UBTM抗体而实施。10.权利要求9的方法，其中所述抗体为多克隆抗体。11.权利要求9的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。12.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中方法包括检测所述样本中两种或多种UBTM家族成员的累积。13.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其还包括检测TOP2A、MDK或BIRC5。14.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其还包括检测选自TOP2A-HOXA13、TOP2A-IGFBP5和TOP2A-SEMA3F的一个或多个标记物对。15.检测膀胱癌的方法，其包括：从疑患膀胱癌患者的生物样本中检测选自图14a或14b的两种或多种BTM家族成员的组合的累积。16.权利要求15的方法，其中生物样本为来自组织或尿。17.BTM或UBTM特异的抗体。18.权利要求17的抗体，其中所述抗体为多克隆抗体。19.权利要求17的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。20.权利要求17到19中任意一项所述的抗体，其中BTM或UBTM选自图3或图4中所示的组。21.抗体混合物，其包含权利要求17的抗体；和针对另一BTM或UBTM的另...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·J·吉尔福德，N·J·克尔，R·波洛克，
申请(专利权)人：环太平洋生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：新西兰,NZ