PCR‑ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种PCR‑ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒及其检测方法，其中试剂盒包含核酸分子标记物标记的检测家蚕微孢子虫的引物对和检测所述核酸分子标记物的ELISA试剂；通过以标记的特异性引物对扩增合适的基因片段，再将扩增产物进行ELISA，筛选的引物具有种特异性，且灵敏度高，可以实现多样本的高通量检测，对家蚕成品卵中家蚕微孢子虫检测具有重要意义。

PCR ELISA assay kit nosemabombycis and its detection method

The invention relates to kits for detection of PCR ELISA method nosemabombycis and detection methods, the detection kit comprising a nucleic acid primer of silkworm molecular markers marker of microsporidia and detection of the nucleic acid molecular marker ELISA reagent; by specific primers for amplification of DNA fragment labeled suitable then, the amplified products were ELISA, primer screening had species specificity, high sensitivity, high throughput detection can achieve multi sample, has important significance for the detection of Bombyx mori eggs in Nosema bombycis.

【技术实现步骤摘要】
PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物
，涉及PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，还涉及检测方法。
技术介绍
家蚕微孢子虫(Nosemabombycis)是一种家蚕常见的致病真菌，其引发的家蚕微粒子病是蚕桑产业中毁灭性的病害，因此家蚕微孢子虫一直被各养蚕国家和地区列为法定的蚕业生产检疫对象。为有效控制蚕业生产家蚕微粒子病，以免其引发家蚕灾难性死亡，如何在成品卵阶段完成家蚕微孢子虫的检测成为蚕业科学研究中的重要工作之一。19世纪60年代，巴斯德(LouisPasteur)发现并利用家蚕微粒子病胚种传染特点，建立了通过检验母蛾的微粒子病感染情况，淘汰感染母蛾产下的卵，确保子代蚕卵无病的防控技术，并成为家蚕微粒子病防控的关键性技术。随着养蚕或蚕种生产规模、方式和技术等的变迁，该技术也随之得到很大的改进，这种改进主要表现为：单蛾全检发展为集团母蛾抽样检验而使检验效率更高，对一代杂交种采用允许一定病蛾率的判断标准而使检验制度下的蚕种生产更为经济，检测相关设施设备条件的改善使检验结果更加准确等。母蛾镜检法属于间接检查，根据微孢子虫的形态、折光性等特征用显微镜鉴别母蛾体内微孢子虫有无，进而判断蚕卵中是否有存在微孢子虫。其操作简单方便、结果直观易懂，但由于其对检测人员要求很高，母蛾样品准备繁琐，同时在镜检工作中容易将家蚕微孢子虫与真菌孢子、寄主组织碎片等混淆，降低了检测工作的速度和准确度，因此建立直接检测成品卵中家蚕微孢子虫的方法已成为蚕业科学研究的重点。随着技术的进步以及仪器设备的更新，已经有越来越多的新型检测方法应用于家蚕微孢子虫的检测，大多基于核酸检测，例如PCR法、LAMP法、荧光定PCR等，这些检测方法相对于传统的母蛾镜检来说灵敏度与准确度都更高，但是有些方法操作上对于检验人员的要求较高，需要受过专业的训练，且对仪器设备的依赖较高、成本较高，使得这些方法目前都还停留在实验室研究阶段。因此，研发一种高效、便捷、灵敏、准确、成本较低、通量高的直接检测成品卵中微孢子虫检测方法，对家蚕微粒子病的防控具有重大意义。1997年，Niemeyer等人创建的PCR-ELISA技术。即将上下游引物进行标记，借助生物素-链酶亲和素系统，PCR产物与预先包被的链霉亲和素的酶标板进行孵育，再加入酶标抗体反应，最后加入底物显色，测定OD值，以此方法检测某种特定基因的存在。此方法弥补了核酸检测的不足，国内外实验均表明PCR-ELISA较琼脂糖电泳灵敏度高出10～100倍；另外酶标仪读出结果客观，主观干扰小；从DNA提取、PCR扩增、再到微孔板孵育显色、判断结果，最快可在一个工作日完成，所用时间短；一块微孔板上可以同时检测多份样品，实现高通量快速检测；所用试剂为常用的缓冲液，配置简便，所用仪器如：酶标仪、PCR仪、温箱，是大多数实验室所具备的，有利于基层推广应用。综上所述，在本检测方法中，于其核酸扩增过程中加入特殊的标记物，将PCR产物作为抗原进行ELISA检测，可以对样品进行高通量检测且其结果判读客观。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒；本专利技术的目的之二在于提供PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，所述试剂盒包含核酸分子标记物标记的检测家蚕微孢子虫的引物对和检测所述核酸分子标记物的ELISA试剂；所述引物对的序列如SEQIDNO.1与SEQIDNO.2，SEQIDNO.43与SEQIDNO.44，SEQIDNO.49与SEQIDNO.50，SEQIDNO.75与SEQIDNO.76或SEQIDNO.77与SEQIDNO.78所示。本专利技术优选的，所述引物对的序列如SEQIDNO.49与SEQIDNO.50所示。本专利技术优选的，检测所述核酸分子标记物的ELISA试剂包括浓度如下的组分：1μg/mL链霉亲和素、含体积分数为2％胎牛血清的PBS溶液、酶标DIG抗体、PBST溶液、体积分数30％的H2O2、500mM草酸。本专利技术优选的，所述核酸分子标记物为生物素和地高辛。本专利技术更优选的，所述试剂盒还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括质量分数10％的KOH，STP裂解液，直径425-600μm的玻璃珠，20mg/mL蛋白酶K，质量分数10％的SDS，酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1的混合液，和无水乙醇；所述STP裂解液各组分浓度如下：质量分数1％SDS，质量分数1％的TritonX-100和质量分数1％的NonidetP40。2、PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的方法，包括如下步骤：(1)样品处理：a.取蚕卵，加入质量分数为10％的KOH处理使卵壳充分软化；b.加入STP裂解液，并加入直径425-600μm的玻璃珠，放入孢子破碎仪中，破碎三次，每次5min；c.1000rpm离心2min，将上清转移至离心管中；d.加入浓度为20mg/mL的蛋白酶K和质量分数10％的SDS，55℃处理30min；e.加入酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1的混合液充分混匀后，于12000rpm离心5min，吸取上清置于离心管中，并重复此步骤；f.向上清液中加入无水乙醇，上下颠倒两次后12000rpm离心5min；g.充分倒掉液体，倒置于吸水纸上，静置5min，加入双蒸水使DNA溶解制得待检测样品模板；(2)将经步骤(1)处理的获得待检测模板用核酸分子标记物标记的检测家蚕微孢子虫的引物对进行PCR扩增，所述引物对的序列如SEQIDNO.1与SEQIDNO.2，SEQIDNO.43与SEQIDNO.44，SEQIDNO.49与SEQIDNO.50，SEQIDNO.75与SEQIDNO.76或SEQIDNO.77与SEQIDNO.78所示；(3)将步骤(2)扩增后的产物进行ELISA，检测在405nm处OD值，检测健康蚕卵基因组为模板的扩增产物为阴性样本，OD值大于阴性对照OD值2.1倍的样本即为阳性样本；OD值小于阴性对照OD值2.1倍的样本即为阴性样本。本专利技术中，步骤(2)中，所述PCR扩增条件为98℃预变性2min，98℃变性10sec，64℃退火15sec，68℃延伸35sec，扩增30个循环；最后68℃延伸3min。本专利技术中，步骤(3)中，所述ELISA检测具体步骤如下：a)酶标板每孔加入1μg/mL的链霉亲和素溶液，4℃过夜或18～25℃处理3h；b)甩干板内液体，每孔加入PBST，震荡5min，甩干板内液体，重复四次；c)将PCR产物用含体积分数为2％胎牛血清的PBS溶液稀释50倍后加入酶标板，每个样品三个重复，18～25℃孵育2h；d)甩干板内液体，每孔加入PBST，震荡5min，甩干板内液体，重复四次；e)加入用含体积分数为2％胎牛血清的PBS溶液按1:1000稀释的酶标DIG抗体稀释液，18～25℃孵育45min；f)甩干板内液体，每孔加入PBST，震荡5min，甩干板内液体，重复四次；g)加入体积比为1:1000的体积分数30％的H2O2和PBST溶液，避光孵育15min；h)加入浓度500mM的草酸溶液进行终止，并在40本文档来自技高网...

【技术保护点】
PCR‑ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含核酸分子标记物标记的检测家蚕微孢子虫的引物对和检测所述核酸分子标记物的ELISA试剂；所述引物对的序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.43与SEQ ID NO.44，SEQ ID NO.49与SEQ ID NO.50，SEQ ID NO.75与SEQ ID NO.76或SEQ ID NO.77与SEQ ID NO.78所示。

【技术特征摘要】
1.PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含核酸分子标记物标记的检测家蚕微孢子虫的引物对和检测所述核酸分子标记物的ELISA试剂；所述引物对的序列如SEQIDNO.1与SEQIDNO.2，SEQIDNO.43与SEQIDNO.44，SEQIDNO.49与SEQIDNO.50，SEQIDNO.75与SEQIDNO.76或SEQIDNO.77与SEQIDNO.78所示。2.根据权利要求1所述PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，其特征在于：所述引物对的序列如SEQIDNO.49与SEQIDNO.50所示。3.根据权利要求1所述PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，其特征在于：检测所述核酸分子标记物的ELISA试剂包括浓度如下的组分：1μg/mL链霉亲和素、含体积分数为2％胎牛血清的PBS溶液、酶标DIG抗体、PBST溶液、体积分数为30％的H2O2、500mM草酸。4.根据权利要求1所述PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，其特征在于：所述核酸分子标记物为生物素和地高辛。5.根据权利要求1所述PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样品处理试剂，所述样品处理试剂包括质量分数10％的KOH，STP裂解液，直径425-600μm的玻璃珠，20mg/mL蛋白酶K，质量分数10％的SDS，酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1的混合液，和无水乙醇；所述STP裂解液各组分浓度如下：质量分数1％SDS，质量分数1％的TritonX-100和质量分数1％的NonidetP40。6.PCR-ELISA法检测家蚕微孢子虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品处理：a.取蚕卵，加入质量分数为10％的KOH处理使卵壳充分软化；b.加入STP裂解液，并加入直径425-600μm的玻璃珠，放入孢子破碎仪中，破碎三次，每次5min；所述STP裂解液各组分浓度如下：质量分数1％SDS，质量分数1％的TritonX-100和质量分数1％的NonidetP40；c.1000rpm离心2min，将上清转移至离心管中；d.加入浓度为20mg/mL的蛋白酶K和质量分数10％的SDS，55℃处理30min；e.加入酚：氯...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘国庆，王锐，周泽扬，宋跃，何章帅，刘璐璐，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50