与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记、方法及应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，公开了一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记、方法及应用，所述分子标记为scd06‑17，包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明专利技术提供的分子标记，结果稳定可靠，且为共显性分子标记，实现了在辣椒苗期对辣椒材料是否含有细胞质雄性不育恢复基因进行鉴定，提高育种效率，加速育种进程，相比较国内外已公布的其它辣椒恢复基因分子标记，在辣椒三系杂交制种和恢复材料分子标记辅助选择育种上具有重要意义。

Restoring gene molecular markers closely linked with the method, and application of Sterile Pepper

The invention belongs to the field of molecular biology technology, and discloses a pepper fertility restoring gene molecular markers closely linked, method and application of the molecular marker for scd06 17, including the nucleotide sequence of SEQ ID shown in the NO.1 nucleotide sequence and SEQ ID NO.2 shown. Molecular markers provided by the invention, the results are stable and reliable, and is a co dominant molecular marker, the pepper seedling of pepper materials containing cytoplasmic male sterility restorer genes were identified, improve breeding efficiency and accelerate the breeding process, other chili compared at home and abroad have been published to restore gene molecular marker, has important significance in Pepper three hybrid seed production and recovery of materials on the molecular marker assisted selection.

【技术实现步骤摘要】
与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记、方法及应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记、方法及应用。
技术介绍
辣椒利用CMS育性基因(Cytoplasmicmalesterility)三系配套制种可以省去人工去雄，提高种子纯度，同时有利于知识产权的保护。但是，如果父本的育性恢复力不强，则会严重影响F1的果形和产量。因此，选育恢复性强、配合力高、农艺性状优良的恢复系(父本)成为辣椒CMS在杂种优势利用中急需解决的主要问题之一。传统的辣椒CMS育性基因选择是根据测交组合的育性表现进行筛选。分子标记辅助选择可直接反映不同材料DNA的多态性差异，并且选择不受时间和环境的影响。通过育性紧密连锁的分子标记直接进行育性基因的选择，可以有效加快恢复系的筛选进程。目前，分子标记辅助育种技术已在多种作物的CMS恢复系选育中得到应用，在杂交后代(或花药再生植株)苗期鉴定有Rf基因的个体，短时间内即可在室内检测大量样品，显著提高育种的选择效率。众多研究认为辣椒育性恢复是由主效恢复基因Rf控制，另外还受修饰基因和环境因素的影响。现有技术中，与辣椒性状相关的分子标记研究主要包括：(1)采用RAPD技术发现位于Rf基因两侧的标记OP131400(0.37cM)和OW19800(8.12cM)；已经有研究学者将分子标记OPP131400转化为更容易操作的OPP13-CAPS(HinfI)标记，此OPP13-CAPS标记为显性标记且通用性较强。(2)利用与Rf基因连锁的RAPD标记OPT-02/570(5cM)开发出的一个STS标记CRF-SCAR。(3)将AFLP标记AFRF8转化成一个与Rf基因紧密连锁的共显性CAPS标记AFRF8CAPS(1.8cM)。(4)在辣椒中存在部分可育(pr)现象，利用AFLP-BSA方法开发出1个与pr基因连锁的分子标记PR-CAPS(1.8cM)，可用于部分育性材料的去除。(5)利用BSA分析法筛选得到PCR标记S4181515，并证明其能用于候选育性材料的初筛。(6)利用AFLP技术开发了3个与Rf基因连锁的标记AFRF1、AFRF3和AFRF4，并转化为可用于PCR的标记类型。(7)发现AF208834标记与Rf基因连锁，遗传距离为20.8cm。(8)利用矮牵牛Rf基因筛选辣椒BAC文库开发出连锁标记BAC13T7SCAR(1.4cM)。(9)以甜椒为试材，利用SRAP分子标记技术筛选得到一个与甜椒恢复基因相关的分子标记，并成功地将此SRAP标记转化为简单、稳定的SCAR标记。(10)利用36份已知基因型(RfRf或rfrf)的辣椒自交系对11对已报道的辣椒恢复基因连锁标记进行适用性检验，发现显性标记CRF3S1S和CRF-SCAR的适用性最广，其准确率分别为91.67％、88.89％；在6对共显性标记中CaRf-FL-M2的适用性最广，其准确率为80.56％。育种实际应用中可以首先利用显性标记CRF3S1S或者CRF-SCAR对辣椒材料进行初次鉴定，对其中含有Rf基因的辣椒材料利用共显性标记CaRf-FL-M2再次进行鉴定。(11)利用已报道的9个与辣椒恢复基因连锁的标记对加工型辣椒CMS不育系83-3A、恢复系812、F1(83-3A×812)、F1'(F1×83-3B)与保持系83-3B回交群体进行试验，发现CRF-SCAR、PR-CAPS和OPP13-CAPS标记与CMS育性恢复基因Rf紧密连锁，但标记CRF-SCAR不需要酶切，通过PCR产物电泳就能鉴定加工型辣椒材料中是否含有恢复基因，且对回交群体辣椒育性鉴定准确度可以达到100％。随着辣椒基因组参考序列数据库的公布，为开发辣椒恢复基因分子标记和图位克隆辣椒恢复基因提供了便利。尽管已经有如此多的分子标记被公开，但是目前尚未发现与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记。
技术实现思路
本专利技术提供的一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记、方法及应用，可以有效鉴定辣椒材料中的细胞质雄性不育恢复基因。本专利技术的第一个目的是提供一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记的分子标记，所述分子标记为scd06-17，包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本专利技术的第二个目的是提供一种利用上述分子标记与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记的方法，包括以下步骤：S1，提取待检测辣椒材料的基因组DNA；S2，PCR扩增：a.反应体系：10μL体系，各组分物质的含量分别为:1μL基因组DNA、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、5μL2×TaqMasterMix、ddH2O补齐10μL，混匀；其中，上游引物的序列如SEQIDNO.3所示，下游引物的序列如SEQIDNO.4所示；b.扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸10min；最后4℃保存；S3，电泳聚丙烯酰胺电泳；S4，银染和显影电泳结束后，将凝胶片进行银染和显影，并进行观察；S5，结果判定若电泳图中可观察到342bp的条带，则说明该待测辣椒材料含有细胞质雄性不育恢复基因；若电泳图中不可观察到342bp的条带，只能观察到321bp的条带，则说明该待测辣椒材料不含有细胞质雄性不育恢复基因。优选的，上述鉴定辣椒雄性不育恢复基因的方法，所述基因组DNA的浓度为30ng/μL，上游引物和下游引物的浓度均为10μmol/L。本专利技术的第三个目的是提供一种上述与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记在辣椒细胞质雄性不育恢复材料的分子标记辅助选育中的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种上述鉴定辣椒雄性不育恢复基因的方法在辣椒细胞质雄性不育恢复材料的分子标记辅助选育中的应用。与现有技术相比，本专利技术提供一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记、鉴定方法及应用，具有以下有益效果：本专利技术在现有研究基础上，进一步开发了与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记scd06-17，并在不同遗传背景的分离群体中验证了该分子标记scd06-17的有效性，鉴定成功率在90％以上，结果稳定可靠，且为共显性分子标记，实现了在辣椒苗期对辣椒材料是否含有细胞质雄性不育恢复基因进行鉴定，提高育种效率，加速育种进程。相比较国内外已公布的其它辣椒恢复基因分子标记，该分子标记作为SSR共显性分子标记，可以同时检测杂交后代的三种基因型，揭示显隐性关系，不需要进行酶切环节，直接利用PCR进行大规模批量检测，在辣椒三系杂交制种和恢复材料分子标记辅助选择育种上更加快速和便利，因此具有重要意义。这为利用分子标记辅助选择转育辣椒恢复基因，为辣椒三系杂交制种奠定基础。附图说明图1为32个辣椒材料的电泳结果；图2为32个辣椒细胞质雄性不育恢复基因的遗传分离群体的电泳结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本专利技术提供的一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记的分子标记，所述分子标记为scd06-17，包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为scd06‑17，包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种与辣椒不育恢复基因紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为scd06-17，包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。2.一种利用权利要求1所述的分子标记鉴定辣椒雄性不育恢复基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，提取待检测辣椒材料的基因组DNA；S2，PCR扩增：a.反应体系：10μL体系，各组分物质的含量分别为:1μL基因组DNA、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、5μL2×TaqMasterMix、ddH2O补齐10μL，混匀；其中，上游引物的序列如SEQIDNO.3所示，下游引物的序列如SEQIDNO.4所示；b.扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸10mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：张强，魏小春，姚秋菊，常晓珂，杨双娟，王志勇，赵艳艳，张晓伟，原玉香，蒋武生，郑直，
申请(专利权)人：河南省农业科学院园艺研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41