本发明专利技术公开了基因纳米载体(4’‑甲基‑2,2’‑联吡啶‑4‑酰胺‑RGDF)双(2,2’‑联吡啶)二氯化钌(Ru‑CO‑RGDF)和Ru‑CO‑RGDF/survivin‑siRNA基因递送系统的制备方法，发明专利技术中Ru‑CO‑RGDF/survivin‑siRNA基因递送系统由基因纳米载体Ru‑CO‑RGDF与鱼精蛋白按浓度比为1:8，按Ru‑CO‑RGDF的浓度为0.21875μg/μL，survivin‑siRNA和DNA复合物比例为2:1组成，具有缓释和靶向作用；本发明专利技术以乳腺癌MCF‑7细胞株为模型评价了复合物的抗肿瘤活性，以及mRNA水平和蛋白水平的基因沉默效率，结果显示Ru‑CO‑RGDF/survivin‑siRNA基因递送系统比各对照组具有更优异的抗肿瘤活性和基因沉默效率。本发明专利技术以荷S180腹水瘤小鼠为模型评价Ru‑CO‑RGDF/survivin‑siRNA基因递送系统的抗肿瘤活性，结果表明Ru‑CO‑RGDF/survivin‑siRNA组具有抗肿瘤效果。
【技术实现步骤摘要】
RGDF靶向的新型钌多吡啶配合物载体的制备和评价
本专利技术涉及序列肽RGDF修饰的钌多吡啶配合物(4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-酰胺-RGDF)双(2,2’-联吡啶)二氯化钌(Ru-CO-RGDF)的制备及Ru-CO-RGDF/survivin-siRNA基因递送系统的构建，并且对其进行了体内外抗肿瘤活性和基因沉默效率的评价。本专利主要是通过RGDF修饰，增强钌多吡啶配合物的靶向性，使在靶部位的浓度增加，从而减小副作用，提高了治疗指数；
技术介绍
目前，癌症已经成为世界第一位致死疾病，治疗癌症是目前科学研究者们的主要目标之一。随着医药和纳米技术的发展，基因治疗癌症成为可能。基因治疗是将外源目的基因通过载体或其它途径导入体内并在靶组织和靶细胞中显示出相应生物学效应从而达到治疗疾病的一种方法。RNAi(RNAinterference)即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA(dsRNA)介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。但是siRNA存在很多缺点，如本身带有负电荷导致不能穿过细胞膜进入细胞，这类问题的解决成为实现利用RNAi达到基因治疗目的的关键。Survivin基因编码产生的Survivin蛋白以二聚体的形式存在,是凋亡抑制蛋白家族(inhibitorofapoptosisproteins,IAPs)的一种新颖的抗细胞凋亡蛋白因子,也是迄今人们所发现的最强的凋亡抑制因子。钌配合物与核酸的相互作用研究已经经历了近三十年的历史，其研究成果目前主要用于以下几个方面：核酸结构探针、核酸分子光开关、pH传感器、化学核酸酶、基因治疗、抗癌药物。目前钌多吡啶配合物Ru-COOH的制备是通过加热回流合成的，其粒径在50-70nm左右，其化学形状稳定，形状为较规则的球形，其具备一般纳米材料的特性，其表面有羧基基团，为化学修饰提供了丰富的反应位点，因此可实现钌多吡啶配合物Ru-COOH的修饰来增加其靶向性。RGDF是一种含“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”氨基酸序列的多肽，可识别肿瘤细胞表面特异表达的整合素，并与其特异性结合从而来介导肿瘤的靶向治疗。经过RGDF序列肽修饰的抗肿瘤药物及其递送系统，可增加药物的主动靶向性，从而达到特异性治疗的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有靶向性的基因载体，Ru-CO-RGDF。本专利技术所述基因载体Ru-CO-RGDF的制备方法，包括以下步骤：合成4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-甲酸与H-R(Tos)-G-D(OBzl)-F-OBzl通过DCC/HoBt法缩合后，再经过强酸脱保护，最后与双(2,2’-联吡啶)二氯化钌缩合，即得。本专利技术的另一个目的在于提供一种基因递送系统，由基因载体Ru-CO-RGDF和抗肿瘤基因治疗药物survivin-siRNA制备而成。本专利技术所述的基因递送系统，基因载体Ru-CO-RGDF和抗肿瘤基因治疗药物survivin-siRNA的重量比为1.66:1。本专利技术所述的基因递送系统，为纳米结构。本专利技术另一个目的在于提供基因递送系统的制备方法。本专利技术所述的制备方法，包括以下步骤：基因载体Ru-CO-RGDF与鱼精蛋白在常温下混合，静置待用，取抗肿瘤基因survivin-siRNA与DNA在常温下混合，室温待用，将上述两者溶液混合后，即得Ru-CO-RGDF/survivin-siRNA。其中，Ru-CO-RGDF由以下方法制备而成：4’-甲基-(2,2’-联吡啶)-4-羧酸与H-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl在THF与少量DMF中通过DDC/HOBt反应，然后再脱掉保护基团，最后与顺式-双(2,2'-联吡啶)二氯化钌在加热回流，氮气保护下反应8小时得到Ru-CO-RGDF。优选的，Ru-CO-RGDF由以下方法制备而成:1)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl的合成精氨酸和天冬氨酸主链用Boc保护氨基端，甘氨酸和苯并氨酸用OBzl保护羧基端，侧链用适宜的保护基(叔丁氧羰基)保护的L-氨基酸，液相法接肽，得到两个全保护的二肽:Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl和Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl。分别用氢解方法脱去OBzl保护和酸解方法脱去Boc保护后，继续用液相法接肽，得到全保护四肽。在冰浴的条件下，用溶有HCl的乙酸乙酯溶液5ml溶解170mgBoc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，搅拌反应，用TLC板监测反应。等反应结束后，抽气，将酸气抽干。即得H-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl。2)合成4’-甲基-(2,2’-联吡啶)-4-酰基-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl将28mg4’-甲基-(2,2’-联吡啶)-4-羧酸与117mgH-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl用液相法接肽，制得124mg全保护的中间体4’甲基-(2,2’-联吡啶)-4-酰基-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl。3)合成4’-甲基-(2,2’-联吡啶)-4-酰基-RGDF用三氟乙酸-三氟甲磺酸混合液(v:v＝3:1)于冰水浴中反应30分钟，加入冰乙醚终止反应后离心，用冰乙醚将产物洗至接近中性，脱去保护基，最终得到目标产物4’-甲基-(2,2’-联吡啶)-4-酰基-RGDF。4)Ru-CO-RGDF的合成顺式-双(2,2'-联吡啶)二氯化钌(48毫克，0.09毫摩尔)和混合物4'-甲基-2,2'-联吡啶-4-酰基-RGDF(56毫克，0.08毫摩尔)在乙醇(10mL)和水的混合物中于黑暗中和在氮气保护下回流进行8小时。将反应混合物通过旋转蒸发仪进行蒸发，后将残余物溶解在5mL水中，向其中加入2毫升饱和NH4PF6，会形成砖红色沉淀，离心后收集沉淀。通过过滤，用水洗涤，并真空干燥后得到一种红橙色粉末。将粉末溶解在2毫升甲醇中，溶液进行过滤，将滤液在真空下蒸发，并将残余物重结晶在甲醇和乙醚的混合溶剂中，并通过C18进行简单分纯，得到50毫克的复杂的Ru-CO-RGDF的六氟磷酸盐,将终产物溶于较少的乙腈中，加入丙酮溶解的四丁基氯化铵溶液，有砖红色沉淀析出，离心后收集沉淀，干燥，得到氯代的终产物Ru-CO-RGDF。优选的，本专利技术所述的基因递送系统的制备方法，包括以下步骤1)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl的合成精氨酸和天冬氨酸主链用Boc保护氨基端，甘氨酸和苯并氨酸用OBzl保护羧基端，侧链用适宜的保护基(叔丁氧羰基)保护的L-氨基酸，液相法接肽，得到两个全保护的二肽:Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl和Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl。分别用氢解方法脱去OBzl保护和酸解方法脱去Boc保护后，继续用液相法接肽，得到全保护四肽。在冰浴的条件下，用溶有HCl的乙酸乙酯溶液5ml溶解170mgBoc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，搅拌反应，用TLC板监测反应。等本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有靶向性的基因载体，Ru‑CO‑RGDF。
【技术特征摘要】
1.一种具有靶向性的基因载体，Ru-CO-RGDF。2.权利要求1所述基因载体Ru-CO-RGDF的制备方法，包括以下步骤：合成4’-甲基-2,2’-联吡啶-4-甲酸与H-R(Tos)-G-D(OBzl)-F-OBzl通过DCC/HoBt法缩合后，再经过强酸脱保护，最后与双(2,2’-联吡啶)二氯化钌缩合，即得。3.一种基因递送系统，其特征在于，由基因载体Ru-CO-RGDF和抗肿瘤基因治疗药物survivin-siRNA制备而成。4.权利要求3所述的基因递送系统，其特征在于，基因载体Ru-CO-RGDF和抗肿瘤基因治疗药物survivin-siRNA的重量比为1.66:1。5.权利要求3所述的基因递送系统，为纳米结构。6.权利要求3所述的基因递送系统的制备方法，包括以下步骤：基因载体Ru-CO-RGDF与鱼精蛋白在常温下混合，静置待用，取抗肿瘤基因survivin-siRNA与DNA在常温下混合，室温待用，将上述两者溶液混合后，即得Ru-CO-RGDF/survivin-siRNA。7.权利要求3所述的基因递送系统的制备方法，其特征在于，Ru-CO-RGDF由以下方法制备而成：4’-甲基-(2,2’-联吡啶)-4-羧酸与H-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl在THF与少量DMF中通过DDC/HOBt反应，然后再脱掉保护基团，最后与顺式-双(2,2'-联吡啶)二氯化钌在加热回流，氮气保护下反应8小时得到Ru-CO-RGDF。8.权利要求3所述的基因递送系统的制备方法，其特征在于，Ru-CO-RGDF由以下方法制备而成:1)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl的合成精氨酸和天冬氨酸主链用Boc保护氨基端，甘氨酸和苯并氨酸用OBzl保护羧基端，侧链用适宜的保护基(叔丁氧羰基)保护的L-氨基酸，液相法接肽，得到两个全保护的二肽:Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl和Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl。分别用氢解方法脱去OBzl保护和酸解方法脱去Boc保护后，继续用液相法接肽，得到全保护四肽。在冰浴的条件下，用溶有HCl的乙酸乙酯溶液5ml溶解170mgBoc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，搅拌反应，用TLC板监测反应。等反应结束后，抽气，将酸气抽干。即得H-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl。2)合成4’-甲基-(2,2’-联吡啶)-4-酰基-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl将28mg4’-甲基-(2,2’-联吡啶)-4-羧酸与117mgH-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl用液相法接肽，制得124mg全保护的中间体4’甲基-(2,2’-联吡啶)-4-酰基-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl。3)合成4’-甲基-(2,2’-联吡啶)-4-酰基-RGDF用三氟乙酸-三氟甲磺酸混合液(v:v＝3:1)于冰水浴中反应30分钟，加入冰乙醚终止反应后离心，用冰乙醚将产物洗至接近中性，脱去保护基，最终得到目标产物4’-甲基-(2,2’-联吡啶)-4-酰基-RGDF。4)Ru-CO-RGDF的合成顺式-双(2,2'-联吡啶)二氯化钌(48毫克，0.09毫摩尔)和混合物4'-甲基-2,2'-联吡啶-4-酰基-RGDF(56毫克，0.08毫摩尔)在乙醇(10mL)和水的混合物中于黑暗中和在氮气保护下回流进行8小时。将反应混合物通过旋转蒸发仪进行蒸发，后将残余物溶解在5mL水中，向其中加入2毫升饱和NH4PF6，...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔纯莹，钟荣荣，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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